Диагностика хламидиозов животных

НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ЖИВОТНЫХ

Диагностика хламидиоза запись на прием в Киеве. Комплексные анализы,Анализы Киев. Портал медицинских услуг medportal.kiev.ua

Патентообладатель(и):

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

Описание изобретения:

Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для широкомасштабной диагностики хламидиозов животных.

Известен набор для диагностики хламидиоза животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), содержащий панели для постановки ИФА, антиген Chlamydia trachomatis, сорбированный на твердый носитель, хламидийную сыворотку, антивидовой коньюгат, субстрат для проведения пероксидазной реакции, буферные растворы, детергент (Твин и др.) и стоп-реагент (HCl) (US 4497899, G 01 N 33/54, опубл. 05.02.85). Однако указанный патент позволяет определять антигены Chlamydia trachomatis в клиническом материале и не позволяет определять антитела.

Целью заявляемого изобретения является набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных путем выявления специфических хламидийных антител в сыворотках крови и другом клиническом материале. Указанная цель достигается тем, что в состав набора входят: специфический хламидийный антиген Chlamydia psittaci из высокоиммуногенного производственного штамма 2-Т ВГНКИ, представляющий собой полисахаридно-белковый комплекс, обладающий группо- и видоспецифичностью, в рабочей концентрации 5-15 мкг/мл адсорбционного буфера, хламидийная (положительная) и нормальная (отрицательная) контрольные сыворотки в разведении 1:50-1:150 в инкубационном буфере, коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, Твин-20, -40, -80 или Тритон Х-305, лимонная кислота, ортофенилендиамин, перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки ИФА.

В состав набора входят следующие биологические и химические компоненты:

1. Специфический хламидийный антиген лиофилизированный из штамма 2-Т 1 ампула (фл. ), объем 1 см 3. рабочее разведение 1:40, титр в ИФА не ниже 1: 320.

2. Хламидийная (положительная) сыворотка лиофилизированная 1 амп. (фл.), объем 1 см 3. рабочее разведение 1:100, титр в ИФА не ниже 1:800.

3. Нормальная (отрицательная) сыворотка лиофилизированная 1 амп. (фл.), объем 1 см 3. рабочее разведение 1:100

Презентация на тему "Алгоритм лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза" - скачать презентации по Медицине

4. Антивидовой коньюгат лиофилизированный 1 амп. (фл.), объем 1 см 3. рабочее разведение 1:40.

5. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, K2 HPO4 · 3H2 O, 1 фл. — 9,12 г.

6. Калий фосфорнокислый однозамещенный, KH2 PO4. 1 фл. — 1,36 г.

7. Натрий хлористый NaCl, 1 фл. — 26,1 г.

8. Твин-20, -40, -80 или тритон Х-305, 1 фл. — 1,5 см 3 .

9. Кислота лимонная безводная, 1 фл. — 0,276 г.

10. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, K2 HPO4 · 3H2 O, 1 фл. — 0,586 г.

11. Ортофенилендиамин (ОФД), 1 фл. — 0,02 г.

12. Гидроперит (перекись водорода), 1 табл. — 0,5 г.

13. Стоп-реагент 2,5 н. раствор HCl.

14. В состав набора также входят четыре 96 луночных полистироловых панелей для постановки реакции ИФА.

Приготовление компонентов набора.

1. Приготовление рабочих буферов

Хламидиоз: инкубационный период

Адсорбционный фосфатный буферный раствор предназначен для растворения и сорбции антигена в лунке панелей: 9,12 г K2 HPO4 · 3 H2 O и 1,36 г KH2 PO4 и 26,1 г NaCl растворяют в 3000 см 3 дистиллированной воды. Адсорбционный буфер представляет собой прозрачный раствор с pH 7,2-7,4. Корректируют pH 0,1М раствором KOH или HCl.

Инкубационный фосфатно-солевой твиновый буферный раствор предназначен для разведения контрольных, исследуемых сывороток и антивидового коньюгата, а также для промывки панелей. В 2800 см 3 адсорбционного буфера растворяют 1,5 см 3 Твин-20, -40, -80 или тритон Х-305.

Субстратный цитратно-буферный раствор pH (5,0-5,2) готовят растворением 0,96 г лимонной кислоты и 2,28 г K2 HPO4 · 3 H2 O в мерной колбе и доводят объем до 100 см 3 дистиллированной водой.

Раствор субстрата готовят не ранее, чем за 10 мин до внесения в лунки панелей. Для этого 0,02 г ортофенилендиамина растворяют в 2 см 3 спирта-ректификата, добавляют 48 см 3 субстратного буфера и вносят 0,8 см 3 раствора перекиси водорода, полученного растворением таблетки гидроперита в 10 см 3 дистиллированной воды. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет.

Раствор, останавливающий ферментативную реакцию — (2,5 н. раствор HCl), готовят путем растворения 8,7 см 3 концентрированной HCl (уд. вес 1,13-1,16) в 50 см 3 дистиллированной воды. Раствор можно хранить при температуре 20 o C в течение 1 месяца.

2. Приготовление специфического хламидийного антигена

Известен способ получения хламидийного антигена для реакции непрямой флуоресценции (Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных. — ТУ 10.19.26-88 утв. ГУВ СССР 22.07.88), включающий культивирование хламидий в куриных эмбрионах, приготовление 20% маточной суспензии, гомогенизацию со стеклянными бусами, инактивацию азидом натрия и 0,1-0,15% формалином, выдерживание при 4 o C в течение 72 часов. Однако известный способ позволяет получить антиген, обладающий низкой активностью и специфичностью для использования его в ИФА для определения антител. Обработка суспензии хламидий 0,1-0,15% концентрации формалина существенно снижает специфическую активность антигена, что уменьшает чувствительность ИФА. В заявляемом наборе хламидийный антиген готовят следующим образом: для этого 4-7-дневные куриные эмбрионы после заражения высокоиммуногенным штаммом 2-Т вскрывают, отделяют желточные мешочки и готовят 10% суспензию на физиологическом растворе, забуференном 0,01М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 и частично гомогенизируют. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком на аппарате типа УЗДН-21 мощностью 22 кГц циклично 10-12 раз по 15 секунд. После чего дезинтеграт центрифугируют при 10 тыс. об./мин в течение 25-30 минут. Образовавшийся средний слой (дебрис — нижний и липидный — верхний отбрасывают) переносят в колбу, добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,1% для консервации. Полученный таким способом антиген хламидий является полисахаридно-белковым комплексом следующего состава: 0,20 мг/мл белка, 0,017 мг/% липидов, 0,36 мг/мл сахара. Антиген смешивают со стабилизатором — 1% декстраном T -70 из расчета 1:1, разливают по 1 мл и лиофилизируют. Эффективность обработки ультразвуком в предложенном режиме исследовали шахматным титрованием исходного антигена с хламидийной сывороткой в ИФА (таблица 1).

По результатам шахматного титрования антигена и сыворотки в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация хламидийного антигена 5-15 мкг/мл адсорбционного буфера при разведении хламидийной сыворотки 1:50-1:150 в инкубационном буфере.

3. Приготовление контрольных сывороток.

Известен способ получения сухих диагностических сывороток из крови овец (барана) для серологической диагностики в реакции РСК, РДСК (Патент СССР N 1711898, A 61 K 39/02, 39/18, G 01 N 33/531 «Способ получения хламидийного антигена для реакции непрямой флуоресценции», Бюл. N 6 от 15.02.92). Способ заключается в том, что сыворотку отделяют от сгустка крови, осветляют центрифугированием в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют на водяной бане при 60 o C 25 мин. Затем сыворотку консервируют 2% борной кислотой из расчета 2 г борной кислоты на 100 см 3 сыворотки, разливают по 1 см 3 и лиофилизируют.

Существенным недостатком лиофилизированных сывороток крови овец, полученных данным способом, является их неполная растворимость и образование хлопьев, для удаления которых требуется дополнительное центрифугирование. Указанные недостатки уменьшают объем сыворотки и снижают активность и специфичность хламидийных сывороток. Образование труднорастворимых хлопьев связано с образованием комплекса липидов с сывороточными белками в процессе лиофилизации. Известно, что сыворотки крови многих животных содержат большое количество липопротеидов низкой плотности. В заявляемом наборе хламидийную сыворотку крови от каждого вида животных (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др. ) отделяют от сгустка, осветляют, центрифугируют в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют при 60 o C 25 мин и охлаждают до 4-5 o C. Сыворотку наливают в химический стакан и при медленном перемешивании на магнитной мешалке добавляют 1М раствор CaCl2 и 10% раствор сульфат декстрана — 500 (СД-500) из расчета на 1 см 3 сыворотки 0,1 см 3 CaCl2 и 0,02 см 3 СД-500. Смесь перемешивают в течение 10 мин, затем центрифугируют 25 мин при 10 тыс. об. /мин. Осадок липидов отбрасывают, а надосадок — сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 г борной кислоты на 100 см 3 сыворотки, разливают по 1 см 3 и лиофилизируют. Эффективность обработки сывороток крови животных растворами CaCl2 и СД-500 контролировали по степени растворимости визуально и в реакции ИФА со специфическим хламидийным антигеном. Использование растворов CaCl2 и СД-500 обеспечивает удаление липидов из нативных сывороток на 85% и обеспечивает полное растворение лиофилизированных сывороток в пределах 2-5 мин без хлопьев. По результатам реакции ИФА оптическая плотность хламидийной сыворотки в разведении 1:100 после обработки была значительно выше, чем до обработки. Отрицательная сыворотка со специфическим антигеном показала отрицательный результат (таблица 2).

Таким образом, положительный эффект от использования предлагаемых контрольных сывороток в заявляемом наборе заключается в полной их растворимости и увеличении специфической активности положительной сыворотки, что отражается на чувствительности ИФА.

4. Приготовление нормальной (отрицательной) сыворотки.

Тульский государственный университет Медицинский институт Лечебный

У животных (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др.), прошедших карантин в течение двух месяцев и отрицательно реагирующих в ИФА с хламидийным антигеном, производят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см 3 от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при 37 o C, затем делают обводку и для отстаивания сыворотку выдерживают 12-14 час при 4 o C. Отстоявшуюся сыворотку сливают во флаконы в асептических условиях и обрабатывают согласно П.З.

5. Получение антивидового коньюгата

Антивидовые иммуноглобулины анти-IgG (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др. ), меченные ферментом пероксидазой, готовят в соответствии с «Временной инструкцией по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой», утв. ГУВ МСХ СССР 19.12.85 ТУ 46-78-85 и укомплектовывают ими набор.

6. Иллюстрация применения набора.

6.1. Подготовка биологических компонентов набора для иммуноферментной диагностики хламидиозов животных.

Содержимое каждой ампулы или флакона N 1 со специфическим хламидийным антигеном растворяют в 40 см 3 адсорбционного буфера, получая рабочую концентрацию антигена 5-15 мкг/мл. Содержимое ампул (фл.) с антивидовым коньюгатом N 4 растворяют в 40 см 3 инкубационного буфера. Положительную и отрицательную (ампулы или фл.) N 2 и N 3 сыворотки растворяют в 1 см 3 инкубационного буфера, получая разведение 1:100. Растворенные антиген, сыворотки, антивидовой коньюгат можно хранить при температуре (5±1) o C в течение 3-4 дней.

6.2. Постановка иммуноферментной реакции (ИФА).

Затраты времени на постановку реакции не превышают 4-5 часов.

Сорбция антигена на панели: во все лунки панели вносят по 0,1 см 3 раствора антигена в рабочей концентрации, приготовленного по п.6.1, закрывают крышкой и выдерживают при температуре (37±1) o C 1,5 часа. Панели освобождают от жидкости встряхиванием, промывают три раза по 1 мин промывающим буфером автоматически или вручную и подсушивают на фильтровальной бумаге.

Титрование сывороток: сыворотки титруют по короткому ряду панели. Во все лунки панели, исключая лунку ряда панели 1A, используемую для контроля субстратной смеси и вывода прибора на «ноль», вносят по 0,1 см 3 инкубационного буфера. В лунки ряда N 2 вносят по 0,1 см 3 положительной сыворотки, подготовленной согласно п. 6.1. ряда N 3 — отрицательной сыворотки, подготовленной аналогичным способом, согласно п.6.1. В лунки остальных рядов вносят по 0,1 см 3 исследуемых парных проб сывороток, предварительно разведенных 1: 100 в инкубационном буфере в отдельных пробирках или планшетах. Содержимое всех лунок титруют по короткому ряду для каждой сыворотки по 4 лунки, используя при этом сменные наконечники к микропипеткам и получают разведение сывороток с 1:200 до 1:1600. Из последних лунок каждого ряда по 0,1 см 3 содержимого удаляют.

При эпизоотологическом обследовании поголовья с целью выявления серопозитивных и серонегативных животных сыворотки не титруют, а используют в одном разведении 1:200, но в двух повторностях, используя для каждой сыворотки по 2 лунки плашки. Постановку реакции и подготовку сывороток осуществляют, как описано выше. Панели закрывают крышкой и выдерживают при температуре (37±0,5) o C в термостате 1,5 часа.

Внесение коньюгата: панели промывают три раза по 1 мин, согласно п.6.2, во все лунки вносят по 0,1 см 3 рабочего раствора антивидового коньюгата, подготовленного согласно п.6.1, и инкубируют в термостате при (37±0,5) o C 1 час и снова промывают три раза по 1 мин. согласно п.6.2.

Геморрой от хламидий - Хламидиоз симптомы, признаки и причины заболевания у детей и.

6.3. Проявление реакции: во все лунки панели вносят по 0,1 см 3 раствора субстрата и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30 мин. Через 30 мин реакцию останавливают, добавляя в каждую лунку 0,05 см 3 2,5 н. раствора соляной кислоты.

7. Учет результатов реакции.

Результат учитывают не позднее 30 мин после проявления реакции визуально или спектрофотометрически.

7.1. Визуальный учет: при наличии специфических антител лунки с исследуемыми сыворотками имеют оранжево-коричневое окрашивание с разведения сыворотки 1:200, сравнимое с цветом раствора в положительном контроле (2-й ряд панели). Отрицательными считают пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

7.2. Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на ИФА — ридере при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической плотности (ОП492 ). Положительными считают пробы, ОП492 которых, начиная с разведения 1:200, в 2 и более раза превосходят оптическую плотность отрицательного контроля, но при этом не должна быть ниже 0,200 о.е. Сомнительными считают пробы, ОП492 которых составляет 0,150-0,199 о.е. Уровень оптической плотности ниже 0,150 о.е. свидетельствует об отрицательной реакции.

Предлагаемый набор был испытан при сравнительном титровании исследуемых сывороток методом ИФА, РСК и РДСК.

Установлено, что в 94% случаях положительные результаты были получены в обоих методах. Все отрицательные сыворотки в ИФА были отрицательными и в РСК, РДСК. Однако в 6% случаях хламидийная инфекция диагностировалась только при помощи заявляемого набора ИФА.

Формула изобретения:

Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, отличающийся тем, что он содержит специфический хламидийный антиген Chlamydia psittaci из штамма 2-Т, представляющий собой полисахаридно-белковый комплекс в рабочей концентрации 5 — 15 мкг/мл адсорбционного буфера, хламидийную (положительную) и нормальную (отрицательную) контрольные сыворотки в разведении 1. 50 — 1. 150 в инкубационном буфере, коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, твин-20, или твин-40, или твин-80, или тритон Х-305, лимонную кислоту, ортофенилендиамин, перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа.

Источник: http://ru-patent.info/21/55-59/2156620.html

Молекулярно-генетический подход в диагностике хламидиозов животных и птиц на основе полимеразной цепной реакции

Проанализированы достоинства и недостатки современных лабораторных методов диагностики хламидиозов животных и птиц. Рассматривается принцип метода полимеразной цепной реакции, обсуждаются перспективы его использования в практической ветеринарии.

Хламидиозная инфекция широко распространена среди практически всех видов млекопитающих и наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода. Больные животные часто становятся источником инфекции работников животноводческих хозяйств, что приводит к возникновению эпидемических вспышек. Распространенность возбудителей хламидиозов в природе среди диких животных и особенно птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (1-3).

Особенностью хламидиозной инфекции, значительно усложняющей эпидемиологический надзор за ней, является часто хроническое, со стертой клинической картиной или латентное ее течение (4). Следовательно, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по своевременной профилактике, а также специфическому лечению хламидиозов животных и людей важное значение имеет как можно более раннее и достоверное обнаружение возбудителя при разных формах заболевания. С этой целью на протяжении последних лет был разработан целый ряд лабораторных методов прямой и косвенной диагностики хламидиозов.

В настоящее время общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считается выделение возбудителя в культуре клеток. Однако этот метод имеет недостатки, существенно затрудняющие его широкое использование в практической ветеринарии. Прежде всего, это высокий риск инфицирования персонала, а следовательно, необходимость проведения работ по выделению возбудителя в специальной режимной лаборатории. Кроме того, культуральный метод трудоемок и занимает много времени. Несмотря на то, что для высева патогена подходит практически любой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от скорости транспортировки проб в лабораторию и соблюдения условий доставки образцов (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных для клеток веществ и т.д.) (1).

Как передается хламидиоз: основные способы заражения хламидиями

Требование наличия живого возбудителя в анализируемой пробе значительно снижает чувствительность культурального метода на заведомо положительных образцах. Так, при выделении бактерий Chlamydia psittaci в культуре клеток из 144 проб, взятых от больных орнитозом птиц, положительные результаты были получены только в 45 случаях (31 %), причем специфичность метода составила 94,1 % (5). Низкая специфичность культурального метода наблюдается, как правило, если для учета результатов анализа используют исключительно микроскопию.

В настоящее время культуральный метод все чаще применяют в общей схеме анализа только на первом этапе накопления специфических антигенов, которые затем выявляют методами иммуноферментного анализа или иммунофлуоресценции, что существенно повышает специфичность и практически не влияет на чувствительность диагностики.

В связи с этим предпринимаются попытки заменить метод культурального выделения хламидий другими методами их прямого обнаружения. Так, в последние годы большое значение приобрел подход, основанный на выявлении антигенов бактерий Ch. psittaci методом АГ-ИФА, имеющим по сравнению с культуральным следующие достоинства: возможность одновременного анализа большого числа образцов, быстрота (продолжительность анализа составляет 4 ч), безопасность для персонала. Поскольку с помощью этого метода выявляются как живые, так и неживые возбудители, то возможна работа с инактивированным материалом, в связи с чем существенно упрощаются требования к условиям транспортировки проб. Это расширяет возможности практического использования метода АГ-ИФА. Вместе с тем для ИФА-детекции антигенов так же, как и для культурального метода, характерны низкая чувствительность и специфичность. Например, при анализе методом АГ-ИФА 144 заведомо положительных образцов фекалий и органов животных чувствительность и специфичность составили соответственно 51 и 93,3 % (5). Необходимо подчеркнуть, что в отличие от культурального метода низкие значения чувствительности и специфичности метода АГ-ИФА связаны в первую очередь с его принципиальными возможностями. Другой причиной низкой чувствительности обоих методов может служить непостоянное выделение возбудителя больными животными, а также латентное протекание инфекции.

Проблема низкой специфичности рассмотренных выше подходов была решена с введением в схему анализа методов прямой и непрямой иммунофлуоресценции в качестве подтверждающего теста. Метод прямой иммунофлуоресценции предусматривает использование меченных флуо-ресцеин-изотиоционатом (ФИТЦ) моноклональных антител как к липо-полисахаридному комплексу, так и к основному белку наружной мембраны (МОМР) хламидий. Для этого фиксированный на предметном стекле мазок обрабатывают флуоресцирующими антителами и после непродолжительной инкубации исследуют под флуоресцентным микроскопом. При непрямой иммунофлуоресценции проводят непрямое окрашивание антигенов в мазке. Вначале мазок инкубируют с немеченой антисывороткой животного, заведомо содержащей антитела к хламидиям, а затем образовавшиеся комплексы антиген-антитело окрашивают антивидовыми меченными ФИТЦ антителами к глобулинам сыворотки, используемой на первом этапе анализа. Методы иммунофлуоресценции не требуют много времени для проведения, а также наличия живого возбудителя в пробе; позволяют выявлять не только корпускулярные антигены, входящие в состав морфологических структур возбудителя, но и растворимые, содержащиеся во включениях. Кроме того, они обнаруживают высокую по сравнению с культуральным методом специфичность (до 99 %) (6).Однако следует отметить, что последняя может быть достигнута только за счет относительно более низкой чувствительности, так как вывод об отрицательном результате анализа делается лаборантом на основании отсутствия хламидий при просмотре достаточного количества эпителиальных клеток. Учитывая, что для достоверного выявления хламидий необходимо обнаружить определенное число элементарных телец во всем исследуемом образце, чувствительность анализа зависит также от опыта работы лаборанта (6).

В последнее время для доказательства хламидиозов животных все чаще используют методы косвенной диагностики, среди которых основное место занимает иммуноферментное обнаружение в сыворотке крови больных животных специфических антител (метод АТ-ИФА). Реакция связывания комплемента (РСК), ранее используемая для этих целей, как было однократно показано, не обладает достаточной чувствительностью (1).

При сопоставлении ИФА-метода выявления антител и прямых методов детекции хламидий, как правило, наблюдается высокий процент дискордантных результатов. Так, при анализе методом АГ-ИФА проб, полученных от 426 сероположительных попугаев, было обнаружено лишь 5,2 % выделителей возбудителя (7). Согласно другим данным, у 30 % сероположительных попугаев, импортированных в ФРГ, удалось выделить бактерии вида Ch. psittaci в культуре клеток, хотя только одной птице был поставлен диагноз "острый пситакоз". В то же время эпидемиологическое обследование в группах внешне здоровых дневных хищных птиц показало высокую долю носительства специфических к хламидиям антител (75-78,6 %) (5). Следовательно, положительные результаты, полученные методом АТ-ИФА, не являются доказательством активного инфекционного процесса и требуют обязательного подтверждения каким-либо прямым методом. Кроме того, эффективность карантинных мероприятий при возникновении угрозы рассеивания инфекции носителями прямо зависит от выбора такого метода диагностики, который позволил бы не только выявить асимптоматичных носителей, но и проследить за их лечением. В подобных ситуациях в связи с тем, что антитела к хламидиям имеют тенденцию достаточно долго сохраняться в крови животных после перенесенной инфекции, предпочтение должно отдаваться методам прямого обнаружения возбудителя.

В настоящее время одним из наиболее перспективных методов прямой диагностики инфекций следует считать специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант этой амплификации — метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В 1983 году Mullis (Cetus Corporation, США) открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей, за что был удостоен Нобелевской премии. В 1984 году исследователи этой корпорации разработали метод ПЦР, позволяющий всего за несколько часов получать миллионы копий выбранного фрагмента ДНК. В настоящее время этот метод практически вытеснил длительную и трудоемкую процедуру ДНК-гибридизации (8). Метод ПЦР позволил достигнуть больших успехов в области генетического картирования, изучения генетического полиморфизма, мутаций и генетических механизмов молекулярной иммунологии, а также в молекулярной вирусологии, онкологии, судебной медицине, диагностике наследственных и инфекционных заболеваний.

Для амплификации специфического ДНК-фрагмента методом ПЦР достаточно знать нуклеотидную последовательность двух коротких участков ДНК, окаймляющих фрагмент-мишень. На основе этих последовательностей химически синтезируют два олигонуклеотида (праймера), которые необходимы для инициации полимеризации ДНК в каждом цикле ПЦР. Длина праймеров (обычно 20-30 нуклеотидов) должна быть такой, чтобы их последовательность была статистически уникальна и не встречалась в других участках ДНК, присутствующей в реакционной смеси. ПЦР включает серию повторяющихся циклов, каждый из которых начинается со стадии денатурации молекулы ДНК (рис.).

Схема ПЦР-анализа клинического материала от инфицированного хламидиями животного:

1 — подготовка проб к проведению ПЦР (очистка ДНК от ингибиторов ДНК-полимеразы и концентрирование);

2 — плавление ДНК (первая стадия ПЦР-амплификации);

3 — отжиг праймеров (вторая стадия ПЦР-амплификации);

Первые симптомы хламидиоза у женщин, как сдавать анализы

4 — достройка комплементарных цепей ДНК (третья стадия ПЦР-амплификации);

5 — продукт ПЦР (ампликон);

6 и 7 — соответственно злектро-роретическая и гибридизационно-ферментная детекция гродуктов ПЦР.

На первой стадии при нагревании реакционной смеси до 96 "С разрываются водородные связи, соединяющие спиральные цепи. На второй стадии температуру реакционной смеси понижают до заранее определенных значений, соответствующих температуре отжига праймеров, что приводит к комплементарному их взаимодействию с последовательностями, окаймляющими фрагмент-мишень. Третьей стадией является элонгация праймеров в сторону фрагмента-мишени под действием ДНК-полимеразы. Продолжительность реакции обычно составляет 30-40 циклов. Поскольку число молекул ДНК удваивается в каждом цикле, то многократное их повторение приводит к экспоненциальному нарастанию (амплификации) количества специфических фрагментов ДНК (ампликонов), которое затем выявляют методом электрофореза или гибридизации с меченым ДНК-зондом.

Возможность быстрого и практически полного обнаружения многих возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных в образцах крови, мочи, слюны, в различных тканях организма методом амплификации генов при помощи ПЦР была продемонстрирована уже через несколько лет после ее открытия. Было показано, что ПЦР обладает высокой чувствительностью и в то же время не требует, подобно серологическим методам, наличия иммунного ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями инфекции и выявлять ее латентное течение. Позже стали разрабатывать варианты ПЦР, позволяющие не только выявлять патогенные микроорганизмы, но и определять их концентрацию в биологическихсредах, активность в организме хозяина, а также различать патогенные формы одного и того же типа возбудителя.

Для диагностики хламидиозов человека и животных ПЦР была впервые применена в 1989 году (9). На модельных системах культур клеток, инфицированных бактериями Ch. trachomatis или Ch. psittaci с известным титром, авторам удалось методом ПЦР дифференцировать эти виды рода Chlamydia и детектировать ДНК хламидий с чувствительностью 1 бактерия на 100 тыс. инфицированных эукариотических клеток. Кроме того, была показана высокая специфичность метода ПЦР: ни один из 13 представителей других родов бактерий не давал положительного ответа. Авторы разработали систему из четырех праймеров, ограничивающих два фрагмента длиной 240 и 119 нуклеотидов рибосомального гена (16S). Первая пара праймеров позволяла детектировать оба вида хламидий. Вторая пара праймеров обладала специфичностью только к бактериям Ch. psittaci. К сожалению, в этой работе был протестирован всего лишь один штамм Ch. psittaci, в связи с чем авторы не смогли сделать вывод о возможности детекции других представителей этого вида предлагаемыми праймерами.

В 1991 году Rasmussen с соавт. предложили оригинальные прайме-ры и изучили их специфичность в ПЦР на препаратах ДНК, выделенных из 24 коллекционных штаммов Ch. psittaci (10). Подобранные праймеры соответствовали консервативным участкам гена главного поверхностного белка (МОМР) хламидий и ограничивали фрагмент длиной около 1000 нуклеотидов. Кроме того, был предложен зонд, комплементарный внутреннему участку амплифицируемого фрагмента. Полный ПЦР-анализ состоял из трех этапов: выделение ДНК, ПЦР и выявление продуктов ПЦР методом дот-гибридизации с радиоактивно меченным зондом. В сравнительных опытах установлено, что гибридизационный метод выявления хламидий на фильтрах не позволяет обнаружить менее 100 тыс. элементарных телец, в то время как чувствительность ПЦР составляет 10 хламидий в пробе, причем 22 из 24 исследованных образцов штаммов Ch. psittaci дали положительный ответ в ПЦР. Поскольку штаммы бактерий с отрицательным в ПЦР ответом были исходно выделены из конъюкти-вальной жидкости коалы, можно думать о значительном отличии ген.-МОМР этих штаммов от всех остальных. Несмотря на то, что исследования были выполнены на упрощенных модельных системах, авторы сделали важный вывод о том, что чувствительность ПЦР определяется всеми тремя этапами ПЦР-анализа, при этом большое значение имеет подготовка проб.

Следовательно, уже в первых работах, посвященных применению ПЦР для обнаружения хламидий, отмечены чрезвычайно важные для диагностики хламидиозов особенности этого метода: высокая чувствительность и специфичность, способность идентифицировать виды хламидий. Позже высокие возможности ПЦР были подтверждены на клиническом материале. Например, Holland с соавт. использовали ПЦР для обнаружения и дифференцирования трех видов бактерий рода Chlamydia:

Ch. trachomatis, Ch. psittaci, Ch. pneumoniae (11). С этой целью авторы разработали оригинальную систему ПЦР-детекции хламидий, состоящую из трех праймеров, комплементарных областям гена МОМР хламидий и рестриктазы EcoRI. Обнаружено, что вид Ch. trachomatis диагностируется всеми тремя праймерами, а три продукта ПЦР имеют сайг рестрикции EcoRI. Фрагмент гена МОМР бактерий Ch. psittaci амплифицировался только двумя праймерами и не расщеплялся этой рестрикгазой. Бактерии С/г. pneumoniae детектировались также одной парой праймеров, но специфичный фрагмент имел сайг рестрикции EcoRI. При этом была продемонстрирована высокая чувствительность и специфичность разработанного варианта ПЦР в модельных условиях. Кроме того, методом ПЦР протестировано несколько клинических образцов, дающих положительный ответ в культуре клеток, и получено 100 % подтверждение результатов.

Аналогичный, но более простой вариант ПЦР предложили Rasmussen с соавт. (12). В области гена МОМР ими была найдена пара праймеров, консервативная для всех трех видов хламидий, но амплифи-цирующая вариабельный фрагмент ДНК. Поэтому после ПЦР проводили рестрикцию ферментами EcoRI и HindIII или Pstl. Этот вариант ПЦР успешно использовали для детектирования и дифференцировки двух штаммов Ch. pneumoniae, 11 штаммов Ch. psittaci и 10 сероваров С/г. trachomatis. С помощью этого метода были протестированы 15 клинических образцов, в 8 из которых культуральным методом выявлены бактерии С/г. trachomatis. ДНК хламидий обнаруживалась методом ПЦР в пяти образцах в том случае, если выявление ампликонов проводили электро-форетическим методом. В то же время наличие ДНК хламидий удалось доказать во всех 8 пробах после ПЦР с последующей радиоактивной гиб-ридизационной детекцией продуктов ПЦР.

В 1991 году появилось сообщение Corcish с соавт. о первом применении метода ПЦР для диагностики пситакоза птиц в практической ветеринарно-диагностической лаборатории (13). Авторы предприняли беспрецедентные (и до настоящего времени) сравнительные исследования по тестированию проб экскрементов птиц методами ПЦР и имму-ноферментного выявления антигена. Вариант ПЦР, использованный в этой работе, был разработан Hewinson с соавт. (14) и представлял собой модификацию метода Rasmussen (10). В общей сложности двумя методами было исследовано более 1000 проб. Обнаружено, что детекция антигенов бактерий Ch. psittaci методом ИФА может давать до 75 % ложнопо-ложительных результатов. В то же время ПЦР, дополненная гибридиза-ционной детекцией ампликонов, выявляла в клиническом материале ДНК хламидий с показателями чувствительности и специфичности, близкими к 100 %. В отличие от анализа культуральным методом, занимавшего до 3 нед, результаты ПЦР обычно получали в течение 48 ч. На основании полученных данных авторы разработали рекомендации для проведения ПЦР-диагностики пситакозов птицы. По их мнению, используемые в настоящее время методы прямого обнаружения хламидий не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью. Однако метод ПЦР позволяет достоверно судить об инфицированности птицы. В связи с тем, что возбудитель выделяется у больного животного непостоянно, необходимо исследовать не менее трех образцов экскрементов от одной и той же особи, взятых в течение 4-5 сут. При скрининговом обследовании птиц с помощью ИФА метод ПЦР должен быть использован в качестве подтверждающего теста. В случае обнаружения контактов заболевших пситакозом птиц или человека со здоровыми людьми или птицами метод ПЦР является методом выбора для лабораторной диагностики орнитоза у контакторов (13).

Значение этой работы для практической диагностики хламидиозов птиц трудно переоценить. Однако предлагаемая авторами методика пригодна для решения только одной прикладной задачи — диагностики хла-мидиозов, вызванных бактериями вида Ch. psittaci. В настоящее время известно, что хламидиозы животных и птиц могут вызываться как минимум тремя из четырех выделенных видов хламидий: Ch. psittaci, Ch. trachomatis и недавно открытым Ch. ресогит (15). Кроме того, метод Corcish с соавт. требует использования радиоактивных изотопов, что делает его затратным, длительным и опасным для персонала и тем самым затрудняет его внедрение в лабораториях ветеринарной службы.

Следующий большой вклад в разработку и внедрение метода ПЦР для диагностики хламидиозов животных и птиц внесли работы Kaltenboeck с соавт. в которых не только решен ряд основных задач практической ПЦР-детекции хламидий, но и доказаны неограниченные возможности использования ПЦР в молекулярной эпидемиологии хламидиозов (16-19). Для этих целей авторы сначала идентифицировали у 24 штаммов хламидий часть нуклеотидных последовательностей, составляющих 81 % целого гена МОМР. Коллекция штаммов включала представителей всех известных сегодня видов хламидий. Полученные последовательности были выравнены друг относительно друга и разбиты на четыре неперекрывающихся кластера, каждый из которых соответствовал одному из четырех видов хламидий. Затем были определены участки, строго консервативные для всех изолятов, и в этих консервативных областях, располагающихся по краям гена МОМР, выбрана система из четырех вложенных родоспецифичных праймеров таким образом, что внешние праймеры ограничивали фрагмент гена МОМР длиной 1120 нуклеотидов, а внутренние — фрагмент длиной 950 нуклеотидов. Продукты ПЦР, полученные с внешними праймерами, подвергали реамплифи-кации с внутренними, а фрагмент длиной 950 нуклеотидов выявляли методом электрофореза. Чувствительность этого нерадиоактивного варианта ПЦР позволяла детектировать не менее трех бактерий в пробе в присутствии фоновой нагрузки ДНК человека, эквивалентной 100 тыс. клеток.

Авторам удалось подобрать систему видоспецифичных праймеров, каждый из которых с общим родоспецифичным праймером мог образовать фрагмент, длина которого была характерна только для одного вид-хламидий. Кроме того, они разработали систему более детального типи-‘ рования хламидий рестрикционным анализом видоспецифичных ПЦР-фрагментов. Для этого были подобраны рестриктазы, позволяющие не только оценивать результаты определения вида, получаемые при использовании видоспецифичных праймеров, но и проводить внутривидовую дифференциацию хламидий. Разработанная система была апробирована на клинических образцах молока, полученных от коров (п == 7) с маститом неясной этиологии. У двух из них были детектированы методом ПЦР бактерии вида Ch. psittaci. Рестрикционный анализ специфических ПЦР-фрагментов позволил определить вид и тип хламидий (птичий тип 2Ь).

Эта работа, несмотря на небольшое число протестированных клинических проб, по-видимому, займет особое место в истории разработки метода ПЦР для диагностики хламидиозов животных. Впервые удалось на основе последовательностей одного гена-мишени создать универсальные родоспецифические праймеры, позволяющие с высокой чувствительностью диагностировать хламидиоз и сразу же давать видовую и типовую характеристику возбудителя. Ценность данных молекулярного типирования возрастает еще больше, если принять во внимание тот факт, что продукт гена, использованного авторами для типирования, может быть использован при разработке вакцин против хламидий. Следовательно, в этих экспериментах были показаны не только диагностические возможности метода ПЦР, но и одновременно на основе данных молекулярных исследований классифицирован возбудитель, что до сих пор представлялось невозможным.

Таким образом, возможность применения ПЦР-диагностики хламид иозов животных в настоящее время продолжает изучаться. Рассмотренные нами данные литературы демонстрируют перспективы, которые открывают разработка и использование этого метода в диагностических ветеринарных лабораториях. Прежде всего, это быстрый и надежный диагноз, своевременная эффективная терапия и научно обоснованная профилактика хламидиозов. Дополнительная информация о разновидности возбудителя, легко получаемая методом ПЦР, позволит проводить эпидемиологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов хламидий.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней. Киев, 1991.

2. Обухов И.Л. Хламидиоз кошек. М. 1994.

3. Терских И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции. М. 1979.

4. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней /Под ред. В.И. Покровского. М. 1993, 1: 357-366.

5. Gerbermann H. Jakоbу J.R. Kosters J. Chlamidienbefimde aus einer groberen Geifrogelhaltung. J. Vet. Med. 1990, 37: 739-738.

6. Вяянанен П. Диагностика хламцдийных инфекций. В сб. Диагностика и лечение хламидийных инфекций. М. 1987.

7. Gerbermann H.,Janeczek F. Chlamydiose bei Vogein: gegenwartige Situation und altemativen der Diagnose und Belcampfung. Pract. Tieiarzt, 1991, 6: 521-528.

8. Saiki R.K. Sharf S.,Faloona F. e.a. Enzymatic amplification ofb-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Sci. 1985, 230: 1350-1354.

9. Pollard D.R. Туlег S.D. Ng С. W. e.a. A polymerase chain reaction (PCR) protocol for the specific detection of Chlamydia spp. Mol. Cel. Probes, 1989, 3: 383-389.

10. Rasmussen S.J. Тimms P. Detection Chlamydia psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. PEMS Microbiol. Lett. 1992, 77: 169-174.

11. Hоlland S.M. Gауdes C.A. Quinn T.C. Detection and differention of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification. J. Infect. Dis. 1990, 162: 984-987.

12. Rasmussen S.J. Douglas P.P. Тimms P. PCR detection and differentiation of Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. Mol. Cel. Probes, 1992, 6: 389-394.

13. Согсish J.D. Вevan B.J. Diagnosis of psittacosis. Vet. Rec. 1991, 12: 42-43.

14. Hewinsоn R.G. Griffiths P.C. Rankin S.E.S. Towards a differential polymerase chain reaction test for Chlamydia psittaci. Vet. Tec. 1991, 128: 381-382.

15. Fukushi H. Hiгai K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants. Int. J. Syst. Bact. 1992, 42: 306-308.

16. Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G. Stоrz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1991, 29: 1969-1975.

17. Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G. Stоrz J. Two-step polymerase chain reactions and restriction endonuclease analyses detect and differentiate ompA DNA of Chlamydia spp. J. Clin. Microbiol. 1992, 30: 1098-1104.

18. Kaltenboeck B.,Storz J. Biological properties and genetic analysis of the ompA locus in chlamidiae isolated from swine. Am. J. Vet. Res. 1992, 9: 1482-1487.

19. Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G. Stоrz J. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the chlamidial species. J. Bact.,1993, 175: 478-502

Источник: http://www.petsinform.com/veterinary/statia/diagnostika/08.html

Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных

A61K39 — Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

Владельцы патента RU 2485972:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") (RU)

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ включает инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии и добавление к ней смеси детергентов — додецилсульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта до конечной концентрации их, равной соответственно 0,1 и 2%. Затем суспензию выдерживают в течение 96 часов при температуре 37°С с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5 соответственно при периодическом перемешивании. Дальнейшую выдержку суспензии проводят в течение 24 часов под вытяжной системой при комнатной температуре. Способ позволяет повысить активность и специфичность антигена, а также исключает использование ядовитых веществ. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к средствам лабораторной диагностики хламидиозов животных.

Хламидиозы — это группа контагиозных заболеваний животных, птиц и человека, вызываемых антигеннородственными и морфологически идентичными микроорганизмами — хламидиями, поражающими практически все системы и органы. Заболевание характеризуется разнообразными клиническими проявлениями: пневмонии, конъюнктивиты, артриты, менингоэнцефалиты, аборты и многое другое.

В настоящее время в ветеринарии для диагностики хламидиоза животных используют реакцию связывания комплемента (РСК), в которой выявляют наличие специфических хламидийных антител с помощью специфического хламидийного антигена. Для постановки РСК используют антиген хламидий, общий для всего семейства Хламидиалес.

Однако недостатком всех известных способов получения антигена является низкая активность и специфичность, приводящая к малоэффективной диагностике хламидиоза в РСК и невозможности ее использования в более чувствительных тестах, например в иммуноферментном анализе (ИФА), кроме того, использование 2-меркаптанола, относящегося к группе сильнодействующих ядовитых веществ, наносит вред здоровью людей и требует специальных условий производства.

При создании изобретения ставилась задача получения хламидийного антигена с высокой активностью и специфичностью, позволяющей проводить диагностику хламидиоза не только в РСК, но и в ИФА, и кроме того, простого, доступного и экологически чистого, при производстве которого не используется вредных для здоровья человека и окружающей среды веществ.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения антигена для диагностики хламидиоза животных, включающей инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии, добавление к ней смеси детергентов — додецисульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта до конечной концентрации их, равной соответственно 0,1 и 2%, с последующей выдержкой в течение 96 часов при температуре 37°С, с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5, соответственно, при периодическом перемешивании, с дальнейшей выдержкой суспензии в течение 24 часов под вытяжной системой при комнатной температуре.

Предложенный способ позволяет повысить активность и специфичность антигена, за счет того что экстракцию антигена эфиром производят не из цельной микробной клетки, а предварительно обработанной, т.е. разрушенной детергентами, где клеточную структуру разрушает додецилсульфат натрия, а этиловый спирт выступает в качестве фиксатора, т.е. предупреждает разрушение данного антигенного комплекса, что улучшает доступность антигена для экстракции эфиром и приводит к повышению степени чистоты и активности полученного антигена. Кроме того, способ получения антигена не включает использование ядовитых веществ, не требует специальных условий производства, т.е. является простым, доступным и экологически чистым.

Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных состоит из нескольких последовательных этапов: получение биомассы хламидий на развивающихся эмбрионах кур; получение полуфабриката антигена, обработка полуфабриката додецилсульфатом натрия и 96,5%-ным этиловым спиртом и экстракция антигена эфиром.

Получение биомассы хламидий на развивающихся эмбрионах кур

Для получения исходного сырья при производстве антигена используют развивающиеся эмбрионы кур, которые заражают в 6-дневном возрасте в желточный мешок суспензией возбудителя хламидиоза (штамм «Ростиново -70») с инфекционным титром 10 -5,5-6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл в предварительно разведенной до 10 -4. Далее зараженные эмбрионы инкубируют при 37-38°С. Исходным сырьем для изготовления антигена служат желточные мешки куриных эмбрионов, павших на 5-7 день после инфицирования, которые отбирают в стеклянные флаконы. От каждого эмбриона отбирают 1-2 г хорион-аллантоисной и желточной оболочек вместе с сопутствующим желтком. Хламидиосодержащий материал до использования хранят в замороженном состоянии при минус 20-30°С, во время хранения его подвергают термолизису путем трехкратного замораживания и оттаивания для лучшего отделения тканевого содержимого от элементарных телец хламидий.

Приготовление полуфабриката антигена

Для получения полуфабриката антигена из хламидиосодержащего материала готовят 20%-ную исходную суспензию на 0,2 М фосфатно-буферном физиологическом растворе (ФБР) рН 7,2-7,4 с содержанием 0,5% фенола, для инактивации возбудителя, следующим образом: хламидиосодержащие оболочки быстро размораживают, взвешивают и суспендируют до 20%-ной концентрации на коллоидной мельнице, добавив расчетное количество ФБР. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 60 минут. В процессе центрифугирования суспензия расслаивается на 3 слоя. Верхний слой желток, нижний слой фрагменты тканей желточного мешка и средний слой собственно суспензия, содержащая элементарные тельца хламидий. После центрифугирования отсасывают средний слой центрифугата — взвесь хламидий. Осадок тканей и верхний желточный слой утилизируют. Для приготовления промышленных объемов антигена целесообразно использовать рефрижераторные центрифуги, рассчитанные на большой объем. Из отечественных моделей наиболее удобной является ЦР6-04 производства ОАО «Завод биофизической аппаратуры» (г.Москва) позволяющая центрифугировать одновременно до 11,0 л суспензии.

Для осаждения хламидий очищенную суспензию центрифугируют при 18-20 тыс. оборотов в минуту в течение 60 минут на высокоскоростных центрифугах. Для центрифугирования больших объемов удобно использовать центрифуги с проточным ротором. Из отечественных центрифуг можно использовать ОТР-101К-01. В процессе центрифугирования хламидии собираются на стенках проточного ротора или на дне стаканов в зависимости от типа центрифуги.

Осадок хламидий ресуспендируется в 0,2 М ФБР из расчета получения первоначального объема. Например, если при производстве первоначально было взято 2,0 кг биомассы, то осадок ресуспендируется в 2,0 л ФБР.

Для обработки полуфабриката антигена используют:

— додецилсульфокислоты натриевую соль (додецилсульфат натрия) C12 H25 O4 NaS, ТУ 6-09-64-75 в классификации ч. (чистый);

— спирт этиловый ректификованный (C2 H5 OH) 96,5%-ной концентрации, ГОСТ Р 51652-2000;

— эфир диэтиловый, ч.д.а. (C4 H10 O) ТУ 2600-001-43852015-10.

Приготовление реагентов.

В полуфабрикате антигена концентрация додецилсульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта должна составлять 0,1% и 2% соответственно, поэтому сначала готовят исходную смесь этих реагентов. Для этого 1,0 г додецилсульфата растворяют в 80 мл дистиллированной воды (для лучшего растворения можно проводить процесс в водяной бане при температуре 40-50°С) и добавляют 20 мл этанола и получают 100 мл смеси, содержащей 1% и 20% реагентов соответственно. Смесь реагентов готовят непосредственно перед использованием.

Эфир используют в готовом виде.

Смесь реагентов добавляют к полуфабрикату антигена, разбавляя в 10 раз, чтобы получить нужную концентрацию реагента. Например, на 900 мл антигена добавляют 100 мл готовой смеси реагентов. Обработку ведут в стеклянных бутылях с герметичными пробками в термостате при 37°С в течение 96 часов, периодически, 2-3 раза в сутки, перемешивая бутыль.

По истечении этого периода к обработанному полуфабрикату добавляют эфир из расчета 1:5 соответственно. На 1000 мл полуфабриката антигена добавляют 5000 мл эфира, герметично закрывают, тщательно перемешивают и оставляют еще на 24 часа под принудительной вытяжной системой при комнатной температуре, периодически перемешивая.

В процессе обработки эфиром полуфабрикат расслаивается на 3 слоя:

— нижний слой: вода (ФБР), содержащий реагенты додецилсульфат и этанол;

— средний слой: клеточный дебрис и балластные вещества;

— верхний слой: эфир с растворенным в нем специфическим хламидийным антигеном.

Через 24 часа верхний слой (эфир) осторожно отсасывают, добавляют к нему ФБР, по объему равный первоначальному объему полуфабриката антигена (1000 мл), и испаряют эфир под принудительной вытяжной системой. В процессе испарения эфира липополисахаридный комплекс (антиген) постепенно полностью переходит в ФБР, в результате чего раствор приобретает белый цвет. Активность и специфичность антигена проверяют в РСК путем его титрования против контрольной положительной и отрицательной сывороток крови животных. Антиген должен реагировать с контрольной хламидийной сывороткой крови и не реагировать с отрицательной сывороткой крови.

Ниже, в таблице №1, приведены результаты испытаний трех серий антигенов, приготовленных по предлагаемому способу. По мере изготовления серий антигенов они исследовались на специфичность и активность и использовались для ретроспективной диагностики хламидиоза у животных.

Для определения специфичности и активности антигенов использовали заведомо отрицательные и положительные сыворотки крови овец, входящие в состав «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Рег.№ПВР-12.7/02109; Сертификат соответствия №РОСС RU.ФВ01.Н21898; ТУ 9388-020-00492374-2007).

Источник: http://www.findpatent.ru/patent/248/2485972.html

Конкурс детских рисунков

Постановка окончательного диагноза на инфекционные болезни невозможна без обнаружения ее возбудителя.

Лабораторная диагностика хламидиоза

В настоящее время для лабораторной диагностики хламидиоза у животных применяют морфологические, иммунологические, вирусологические, молекулярно-генетический и серологические методы в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных», утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 г №13-7-2/643, в соответствии с которыми в ветеринарную лабораторию для исследования необходимо направлять:

  • сыворотку крови в количестве 3-5 см3 от абортировавших или подозрительных по заболеванию животных, а также во всех случаях, предусмотренных действующей инструкцией. Кровь от абортировавших животных берут дважды: в период клинического проявления болезни и повторно, от них же, через 14-21 день. Сыворотки направляют в лабораторию в количестве 1-2 см3;
  • патологический материал (соскобы с конъюнктивы, гениталий, фекалии берут только одноразовыми или стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками с физраствором в количестве 1 см3 и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал можно не более 7 суток при 4 оС и 10-12 мес при температуре минус 20 оС;
  • пробы эякулята или замороженной спермы, полученные от производителей, подозрительных по заболеванию. Пробы эякулята направляют для исследования в количестве 1 см3; замороженную сперму в количестве не менее 2 гранул доставляют в лабораторию в контейнере с жидким азотом или в пробирке с сухим льдом;
  • патологический материал от павших или убитых больных животных (кусочки паренхиматозных органов, лимфатических узлов и семенников), от абортировавших животных (кусочки плаценты);
  • абортированные плоды целиком или паренхиматозные органы и сычуг плода.

Патологический материал отбирают в стерильные, герметически закрывающиеся флаконы не позднее двух часов после гибели, убоя животного или аборта.

Флаконы с патматериалом помещают в термос со льдом, а абортированные плоды во влагонепроницаемую тару и в тот же день, но не позже 24 часов, доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих распространение возбудителя инфекции.

Данные о существующих методах диагностики хламидиозов, используемом материале и продолжительности исследования приведены в таблице.

Методы лабораторной диагностики хламидиозов

материал для исследования

Источник: http://vetusklinika.ru/facilities/laboratory/diagnosis-chlamydia/

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему: Диагностика и профилактика хламидиоза домашних плотоядных животных

Оглавление диссертации Шамсутдинова, Нажия Вагизовна. 2002. Казань

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1:1. Характеристика возбудителя.

1.1.1. Таксономическое положение хламидий.

1.1.2. Морфология и цикл развития хламидий

1.1.3. Химический состав хламидий

1.1.4. Антигенная структура и иммуногенные свойства хламидий

1.2. Лабораторная диагностика хламидиоза.

1.2.1. Выявление морфологических структур возбудителя в исследуемом материале

2.3. Сыворотки и патологический материал

2.4. Индикация возбудителя в патологическом материале.

2.5. Серологические реакции

2.6. Штаммы хламидий

2.7. Получение хламидийного антигена для иммуноферментного анализа

2.8. Разработка инактивированной вакцины против хламидиозов плотоядных

2.9. Статистическая обработка результатов исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Степень распространения хламидийных инфекций среди поголовья домашних плотоядных животных.

3.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител.

3.2.1. Подбор метода получения хламидийного антигена

3.2.3. Конструирование иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител

3.2.4. Сравнительное изучение эффективности РСК и ИФА для ретроспективной диагностики хламидиоза домашних плотоядных

3.3. Серологический скрининг домашних плотоядных животных в отношении хламидийной инфекции.

3.4. Разработка специфического препарата для профилактики хламидиоза плотоядных животных.

3.4.1. Получение инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза плотоядных животных

3.4.2. Изучение безвредности, антигенной активности и иммуногенности вакцинного препарата для профилактики хламидиоза плотоядных животных в лабораторных условиях

3.4.3. Иммуноморфологическая оценка вакцины против хламидиоза плотоядных животных (ВНИВИ)

3.4.4. Сравнительная оценка различных биопрепаратов для специфической профилактики хламидиоза домашних плотоядных

3.4.5. Использование инактивированной вакцины против хламидиоза плотоядных животных в ветеринарной практике

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Шамсутдинова, Нажия Вагизовна, автореферат

Актуальность темы. Хламидийные инфекции широко распространены среди всех видов млекопитающих животных и птиц. Заболевание наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода.

Больные животные часто становятся источником инфекции для работников сельского хозяйства и перерабатывающих производств, что приводит к возникновению эпидемических вспышек. Распространенность возбудителей хламидиозов в природе среди домашних и диких животных, а также птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (12, 71, 101, 291).

В доступной литературе имеются единичные сообщения о хламидийной природе заболеваний у домашних собак и кошек (52, 53, 71, 72, 135). Тем не менее, многие вопросы эпизоотологии, этиологии, симптоматики, патогенеза, диагностики, лечения и-профилактики хламидиоза домашних плотоядных животных остаются нерешенными и требуют детального изучения.

Лабораторная диагностика хламидиоза включает обнаружение возбудителя в органах и тканях путем световой и люминесцентной микроскопии, выделение возбудителя на куриных эмбрионах и культурах клеток, выявление в сыворотках крови, больных и переболевших животных комплемент связывающих антител. Эти тест-системы имеют целый ряд недостатков: длительность получения ответа, низкая чувствительность и специфичность, субъективность оценки результатов исследования.

В последние годы для индикации и идентификации хламидий предложены современные иммунохимические и молекулярногенетические методы, такие как: иммуноферментный анализ, иммуноблотинг, гибридомные технологии, полимеразная цепная реакция и др. (8, 30, 34, 58, 76). Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и меж-штаммовые различия хламидий. Исходя из этого, перспективным является совершенствование лабораторной диагностики хламидийных инфекций у домашних плотоядных с учетом достижений современной биотехнологии.

Приоритетным в профилактике и ликвидации хламидиозов сельскохозяйственных животных остается применение антимикробных препаратов и вакцин. Разработаны и внедрены в ветеринарную практику биопрепараты при хламидийных инфекциях крупного и мелкого рогатого скота, свиней и птиц (49, 96, 109, 117), разработана и апробирована в производственных условиях вакцина против хламидиоза пушных зверей (87).

Несмотря на это, вопросы специфической профилактики хламидиоза у домашних плотоядных до настоящего времени остаются открытыми. Кроме того, актуальным является разработка научно обоснованных мероприятий по диагностике, профилактике и ликвидации инфекционных болезней хламидийной природы у мелких домашних животных.

Цель и задачи исследований. Цель исследований — усовершенствовать средства диагностики и профилактики хламидиоза домашних плотоядных животных (собак и кошек).

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

— провести комплекс исследований по выяснению встречаемости хламидиоза при различной патологии у домашних плотоядных животных;

— разработать тест-систему для серологической диагностики хламидиоза у собак и кошек иммуноферментным методом;

— разработать инактивированную вакцину против хламидиоза плотоядных животных.

Научная новизна. Разработан новый метод получения антигена из очищенной культуры хламидий.

Впервые сконструирована и апробирована в лабораторных и производственных условиях иммуноферментная тест-система для индикации в сыворотках крови домашних плотоядных животных (собак и кошек) противохламидийных антител.

С использованием разработанного набора диагностикумов проведен серологический скрининг спонтанно зараженных хламидиями мелких домашних животных.

Разработана инактивированная эмульсионная вакцина против хламидиоза плотоядных животных, которая успешно апробирована в ветеринарной практике.

Практическая ценность. Разработана иммуноферментная тест-система для ретроспективной диагностики хламидиоза у домашних плотоядных.

Установлена возможность использования указанной тест-системы для определения напряженности иммунитета у собак и кошек после вакцинации против хламидиоза.

Разработана, апробирована и успешно внедрена в ветеринарную практику вакцина против хламидиоза домашних плотоядных.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативно-технические документы:

— во "Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза плотоядных животных (пушных зверей, собак и кошек) инактивированной эмульсионной (в порядке опыта)", утвержденное ГУВ Кабинета министров РТ 21 марта 2000 г.;

— во "Временную инструкцию по изготовлению и контролю иммунофермент-ной тест-системы для выявления хламидийных антител у собак и кошек", утвержденную ректором КГАВМ 18 марта 2002 г.;

— в "Технические условия на опытную партию иммуноферментных тестсистем для выявления хламидийных антител у собак и кошек", утвержденные ректором КГАВМ 18 марта 2002 г.;

— во "Временное наставление по применению иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у собак и кошек", утвержденное ГУВ Кабмина РТ 18 марта 2002 г.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

— Ежегодных итоговых заседаниях ученых советов Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (1999-2001 г.г.).

— Научно-практических конференциях по проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 1999, 2001 и 2002 г.г.).

— Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета (Казань, 2000 г.).

— Научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных" (Киров, 2001 и 2002).

— Научно-практической конференции "Актуальные вопросы ветеринарной медицины домашних животных" (Екатеринбург, 2000 и 2001 г.г.).

— Научно-практической конференции "Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития" (Саратов, 2001 г.).

— IX и X международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2001 и 2002 г.г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ. Разработаны нормативно-технические документы на биопрепараты: два наставления, одна инструкция и одни технические условия.

Основные положения диссертации, выдвигаемые для защиты:

— результаты клинико-эпизоотологических и лабораторных исследований поголовья домашних плотоядных в отношении хламидийных инфекций;

— оценка эффективности общепринятых, разработка и совершенствование методов ретроспективной диагностики хламидиозов собак и кошек;

— разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза 9 плотоядных животных.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах компьютерного текста (текстовый редактор "Mikrosoft Word 2000", стиль "Times New Roman", размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 295 источника, в том числе 155 иностранных и 9 ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 14 рисунками. Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

Заключение диссертационного исследования на тему «Диагностика и профилактика хламидиоза домашних плотоядных животных»

5. ВЫВОДЫ

1. Клинико-эпизоотологическими и лабораторными исследованиями установлено значительное распространение у мелких домашних животных хла-мидийных инфекций:

— симптомы характерные для хламидийных инфекции встречаются у 5-20% от общего числа собак и кошек, владельцы которых обращаются к ветеринарным специалистам.

— в реакции связывания комплемента с хламидийным антигеном в диагностических титрах реагируют 13,2% сывороток крови, полученных от подозрительных по заболеванию хламидиозом домашних плотоядных.

— при исследовании методом люминесцентной микроскопии клинических материалов, полученных от подозрительных по заболеванию хламидиозом собак и кошек, в 62,5% случаях выявляется специфическое внутриклеточное свечение хламидийного антигена.

2. Комбинированное использование при диагностике хламидиоза у собак и кошек люминесцентной микроскопии (РИФ) и серологических тестов (РСК) позволяет выявлять на 33,3 % больше реагирующих животных.

3. Сконструированная иммуноферментная тест-система для выявления хламидийных антител у собак и кошек эффективна при подтверждении ранее установленного другими методами диагноза на хламидиоз у спонтанно больных собак и кошек, серологическом скрининге поголовья мелких домашних животных в отношении хламидиоза, а также оценке иммунитета у вакцинированных животных.

4. Анализ результатов исследования сывороток крови подозрительных по заболеванию собак и кошек иммунопероксидазным методом показал, что диагностический титр при индикации хламидийных антител в ИФА должен составлять 1:100 и выше.

104

5. При сравнительном исследовании сывороток крови, полученных от подозрительных по заболеванию хламидиозом домашних плотоядных, в РСК и ИФА с хламидийным антигеном в диагностических титрах реагируют соответственно 13,2% и 31,7%, что свидетельствует о высокой специфичности последней.

6. Серологическим скринингом поголовья собак и кошек в г. Казани выявлено 15,8% домашних плотоядных, в сыворотках крови которых циркулируют специфические хламидийные антитела.

7. Разработанная вакцина против хламидиоза плотоядных животных является безвредной, стерильной и иммуногенной при испытании в лабораторных условиях.

8. Однократная иммунизация собак и кошек вакциной против хламидиоза плотоядных животных в условиях ветеринарной клиники вызывает образование хламидийных антител, выявляемых в РСК и ИФА в титрах 1:10-1:40 и 1:100-1:400 соответственно, у 100% вакцинированных особей.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований внесены следующие практические предложения:

1. С целью предупреждения заболевания домашних плотоядных хламидиозом ветеринарные специалисты обязаны регистрировать все случаи абортов и мертворождений у самок, уретритов и орхитов у самцов, конъюнктивитов, а также гибели приплода в первые дни жизни и принимать все меры для установления причин, вызвавших эту патологию;

2. Руководители и ветеринарные специалисты клубов по разведению собак и кошек обязаны учитывать эпизоотическое состояние хозяйств, в которых заготавливаются корма животного происхождения для домашних плотоядных, а при необходимости принимать меры для исследования их лабораторными методами.

3. Недопустимо использование подозрительных по заболеванию животных для получения потомства до выяснения диагноза. Самцов, при спаривании л с которыми у самок наблюдаются аборты, мертворождения и рождение слабого нежизнеспособного молодняка, для дальнейшего разведения не допускаются и должны подвергаться лабораторным исследованиям на хламидиоз.

4. При диагностике заболевания у мелких домашних животных (собак и кошек) необходимо использовать сочетание серологических тестов и методов индикации антигенов хламидий в тканях;

5. Иммуноферментная тест-система для выявления хламидийных антител у собак и кошек предложена для промышленного изготовления (Временное наставление по применению иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у собак и кошек, утверждено ГУВ Кабмина РТ 18 марта 2002 г.) и может быть использована в ветеринарной практике для подтверждении ранее установленного другими методами диагноза на хламидиоз у спон

106 танно больных собак и кошек, серологическом скрининге поголовья мелких домашних животных в отношении хламидиоза, а также оценке иммунитета у иммунизированных животных;

6. Для специфической профилактики заболевания рекомендуется прививать домашних плотоядных специфическими биопрепаратами. Вакцина против хламидиоза плотоядных животных (ВНИВИ) предложена для промышленного изготовления (Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза плотоядных животных инактивированной эмульсионной, утверждено ГУВ Кабинета министров РТ 21 марта 2000 г.);

7. Следует вести разъяснительную работу среди владельцев домашних плотоядных об опасности данного заболевания для человека. Лица, ухаживающие за больными животными, а также ветеринарные специалисты, оказывающие гинекологическую и терапевтическую помощь, должны соблюдать меры личной профилактики.

Заканчивая работу, выражаю благодарность ректорату Казанской академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана и дирекции Республиканского Центра по профилактике и борьбе со СПИДом (г. Казань) за предоставленную возможность выполнения и оформления работы.

Приношу искреннюю признательность и благодарность моему научному руководителю кандидату биологических наук Валерию Валентиновичу ГЕРАСИМОВУ и научному консультанту профессору Рустаму Хамитовичу РАВИЛОВУ за повседневное руководство и помощь при работе над диссертационной темой.

Выражаю сердечную благодарность сотрудникам отдела культивирования и идентификации вирусов РЦГТБ СПИД, лаборатории контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора ВНИВИ, кафедры патологии мелких животных и оперативной хирургии и других подразделений КГАВМ, а также руководству и специалистам ветеринарных клиник и лабораторий за чуткое отношение и товарищескую помощь при выполнении экспериментальной части работы.

Заключение.

Известно, что домашние плотоядные нередко подвержены инфекционным заболеваниям, характеризующимся различными нарушениями течения беременности, рождением слабого нежизнеспособного молодняка, поражением мочеполовой сферы у самцов, конъюнктивитами и другими симптомами, этиология которых зачастую остается невыясненной. Исходя из этого, особого внимания заслуживает проблема установления природы, в т.ч. и хламидийной, этих патологий.

Среди поголовья домашних плотоядных города Казани нами проведено эпизоотологическое обследование с целью установления причин возникновения и закономерностей распространения хламидийных инфекций. Были выявлены потенциальные источники и совокупность факторов передачи возбудителей инфекции, а также контингент восприимчивых животных.

При разведочных серологических исследованиях собак и кошек установлена серопозитивность в РСК соответственно 13,9 и 12,8% животных, из числа подозрительных по заболеванию хламидиозом.

В результате лабораторных исследований клинического материала от этих животных методом люминесцентной микроскопии в 62,5% случаях в мазках-отпечатках РИФ было выявлено специфическое внутриклеточное свечение хламидийного антигена. Корреляция результатов РСК и РИФ составила 66,1%.

Разработана иммуноферментная тест-система для выявления хламидийных антител в сыворотках крови собак и кошек. Создан диагностический набор биопрепаратов.

Детальное описание разработанной методики нашло отражение в нормативно-технических документах: а) Временной инструкции по изготовлению и контролю иммунофермент-ной тест-системы для выявления хламидийных антител у собак и кошек; б) Технических условиях на иммуноферментную тест-систему для выявления хламидийных антител у собак и кошек (ТУ 9388-001-00493623-02);

88 в) Временном наставлении по применению иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у собак и кошек (в порядке опыта).

Кроме того, нами испытана возможность использования этого набора препаратов для оценки поствакцинального иммунитета, а также серологического скрининга поголовья мелких домашних животных (собак и кошек) в отношении хламидийных инфекций.

Для специфической профилактики хламидиозов плотоядных животных разработана инактивированная эмульсионная вакцина. Изготовлена опытно-промышленная партия биопрепарата, которая успешно прошла лабораторные и производственные испытания. В производственных условиях вакцина использована для иммунизации собак и кошек, содержащихся в домашних условиях. Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза плотоядных животных инактивированной эмульсионной, утверждено ГУВ Кабинета министров РТ 21 марта 2000 г.

Внедрение этих разработок в ветеринарную практику специалистами ветеринарных лечебниц позволяет успешно бороться с хламидиозами домашних собак и кошек.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

В условиях загрязнения окружающей среды, повышения уровня фоновой радиации и высокой степени урбанизации перед человечеством возникла проблема иммунодефицита, который становится причиной снижения резистентности человека и животных к возбудителям инфекционных болезней. В настоящее время регистрируется целый ряд инфекционных болезней вирусной и бактериальной природы, которые в последние 20-30 лет получили значительное распространение среди людей и животных. Одним из таких заболеваний является хламидиоз.

Многие вопросы диагностики, профилактики и ликвидации хламидиозов сельскохозяйственных животных (крупного рогатого скота, овец, коз, свиней и лошадей) изучены достаточно хорошо, результаты этих исследований широко используются в ветеринарной практике. Однако в доступной литературе нами были найдены лишь единичные сообщения об этиологической роли хламидий в патологии мелких домашних животных (19, 52, 71, 72, 92, 135, 153, 182, 248).

Недостаточная изученность данного вопроса; значительный экономический ущерб, причиняемый инфекционными болезнями служебному собаководству и заводчикам собак и кошек; моральный ущерб, причиняемый владельцам при заболевании домашних питомцев; отсутствие или несовершенство методов диагностики, мер борьбы и профилактики хламидиоза явились основанием для изучения данного заболевания у домашних плотоядных.

В целях установления этиологической роли хламидий в патологии беременности самок, поражения мочеполовой сферы у самцов, в проявлениях кера-токонъюнктивитов, поражении центральной нервной системы и др. а также гибели молодняка в первые дни после рождения, нами среди поголовья домашних собак и кошек в городе Казани, были проведены эпизоотологические, клинические, серологические, патологоанатомические исследования; а также совершенствование методов диагностики и специфической профилактики хламидиозов.

При анализе эпизоотической ситуации учитывали условия содержания и кормления животных, результаты щенения самок и сохранности щенков, результаты экспертиз ветеринарных лабораторий, другие показатели и материалы. Проводились разведочные серологические исследования сывороток крови подозрительных по заболеванию хламидиозом мелких домашних животных.

В результате проведенной работы установлено, что причиной широкого распространения хламидиозов среди домашних плотоядных (собак и кошек) оказались: отсутствие эффективных средств диагностики, профилактики и борьбы с данной инфекцией; недостаточное информирование владельцев о возможности заболевания их питомцев хламидийными инфекциями; нарушение правил содержании и спаривании мелких домашних животных; бесконтрольное использование для их кормления продуктов убоя сельскохозяйственных животных и другие факторы.

По данным, полученным из разных источников, от 5 до 20% домашних плотоядных, владельцы которых обращаются к ветеринарным специалистам, имеют клинические признаки, характерные для хламидийных инфекций, и этиология их остается не выясненной. По нашему мнению и по мнению ряда авторов (71, 72, 74, 182), хламидии могут играть значительную этиологическую роль при различной патологии у домашних собак и кошек.

Лабораторная диагностика хламидиоза представлена вполне тривиальным набором методов.

Цитологический метод, основанный на визуальном исследовании прокрашенного мазка под большим увеличением светового микроскопа (х900-1500), являясь одним из наиболее старых, тем не менее, до сих пор не утратил своего значения. Достоинством цитологических методов является дешевизна и возможность одновременного выявления других инфекций; недостатком — низкая чувствительность (по разным оценкам 10-40%). Поэтому упомянутые методы используются в ветеринарной практике, в основном, как дополнительные или мониторинговые.

Культуральный метод основан на способности хламидий к размножению на перевиваемых линиях клеток млекопитающих или клеток желточных мешочков куриных эмбрионов. Культуральный метод считается "золотым стандартом" с условной чувствительностью — 100% (в действительности — не более 80%). Чувствительность остальных методов принято выражать в процентах по отношению к культуральному методу. К недостаткам метода следует отнести его трудоемкость и длительность, а в случае с мелкими домашними животными также отсутствие специальных культур клеток.

Для совершенствования диагностики хламидиоза в последние годы предложены иммуноферментные и иммунофлюоресцентные методы выявления антигена в клиническом материале. Первый из них не получил широкого распространения в ветеринарной практике из-за высокого процента ложноположи-тельных и ложноотрицательных результатов исследования. Второй в настоящее время является одним из наиболее перспективных экспресс методов диагностики заболевания. Несмотря на высокую чувствительность и специфичность, метод иммунофлуоресценции не достаточно широко используется в ветеринарных лабораториях при диагностике хламидиозов. Это было, главным образом, связано с отсутствием специальных диагностических наборов, оборудования и специалистов, а также дискредитацией метода некомпетентными лицами, использующими при исследованиях флуоресцирующие антитела с низкими показателями красящего титра и неадекватно оценивающими результаты исследований.

Следует отметить, что медицинские специалисты сравнительно давно, широко и с успехом используют РИФ для ранней диагностики хламидийных инфекций человека (119).

Недостатками указанных методов является, необходимость специального оборудования и реактивов, а также высокой квалификации исследователей.

Использование серологических методов для выявления хламидийных антител при диагностике хламидиоза у человека и животных не позволяет с достаточной степенью уверенности говорить о наличии или отсутствие данного заболевания, т.к. эти тесты не позволяют отличить наличие инфекции в настоящее время, перенесенное заболевание и вакцинный иммунитет. Кроме того, специфика паразитирования хламидий в организме хозяина обуславливает не всегда адекватную заболеванию ответную иммунную реакцию зараженного организма. В связи с этим, в настоящее время в медицинской практике имму-ноферментный метод выявления хламидийных антител используют главным образом для подтверждения диагноза установленного другими методами (119).

Общепринятым тестом для ретроспективной диагностики хламидиозов, применяемым во всех странах мира, является реакция связывания комплемента (81, 128, 130, 140 ,235, 236, 284 и другие). У нас в стране разработаны "Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных", утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 30 июня 1999 г. где также рекомендуется применять РСК в качестве серологического метода диагностики и при этом связывание комплемента сывороткой крови в разведении 1:5 считают сомнительной реакцией, а в разведении 1:10 и более принято в качестве диагностического титра.

Для постановки реакции в нашей работе мы использовали групповидос-пецифический антиген, изготовленный по методу Боровика Р.В. с соавт. (9) в условиях лаборатории вирусологии ВНИВИ, согласно "Временных инструкций по изготовлению, контролю набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных", утвержденных ГУВ Госагропро-ма СССР 30 ноября 1987 года.

При исследовании в РСК 287 сывороток, полученных от подозрительных по заболеванию хламидиозом домашних плотоядных в диагностических титрах реагировали 38 (13,2%) животных из числа исследованных, число реагирующих колебалось в пределах 4,4-19,0% по разным группам. Эти данные подтверждают результаты исследования сывороток крови сельскохозяйственных животных (22, 130), пушных зверей и домашних плотоядных (53, 71, 92, 87, 88).

От подозрительных по заболеванию хламидиозом собак и кошек получали клинический материал. В РИФ было исследовано 48 проб, из них 20 были взяты у собак и 28 у кошек. В 30 (62,5%) случаях методом люминесцентной микроскопии в мазках-отпечатках было выявлено специфическое внутриклеточное свечение хламидийного антигена (12 у собак и 18 у кошек). В РИФ возбудитель чаще всего обнаруживался в мазках-отпечатках с конъюнктивы и со-скобах с уретры.

Обобщенные результаты исследования подозрительных по хламидиозу домашних плотоядных животных (собак и кошек) в РСК и РИФ показали, что эти методы дополняют друг друга при индикации заболевания у мелких домашних животных. Об этом говорит высокое значение суммы показателей "РСК-/ РИФ+", "РСК±/ РИФ-" и "РСК+/ РИФ-", которая составляет 33,3%. Иными словами в эту группу входят животные, у которых хламидиоз установлен одним из тестов (РСК или РИФ), причем в первом случае мы обнаруживаем антитела, а во втором антиген. Таким образом, используя комбинацию двух разных методов диагностики, нам удается выявить большее число реагирующих животных. Сочетания ретроспективных тестов и методов индикации антигена в тканях широко используется в гуманитарной медицине (119).

Следует также отметить, что для кошек сумма вышеуказанных показателей почти в два раза выше (39,3%), чем для собак (20,0%). Это, скорее всего, связано с тем, что у первых заболевание чаще проявляется конъюнктивитами, при которых циркулирующие в крови антитела образуются в небольшом количестве (общепринятые методы серологической диагностики их не обнаруживают), в тоже время генитальная форма хламидиоза у кошек, хотя и сопровождается образованием антител в диагностических титрах, не всегда протекает типично, поэтому хламидийный антиген при патологиях органов размножения малодоступен для индикации люминесцентным методом.

Учитывая высокую чувствительность, специфичность и экспрессность иммунопероксидазных методов по сравнению с РСК при выявлении антител в сыворотках крови, нами была проделана работа по разработке иммуноферментной тест-системы для ретроспективной диагностики хламидиоза у мелких домашних животных (собак и кошек). К началу наших исследований в доступной литературе имелись сведения об использовании подобных тест-систем для выявления хламидийных антител у человека и животных (15, 33, 65, 68, 103, 105, 121, 128, 129, 264, 265, 279 и другие).

Нами были испытаны различные способы получения антигенов для модельных опытов и разные варианты выполнения ИФА. При выполнении твердофазного варианта ИФА важным моментом, предшествующим самой реакции, является подготовка антигена. Именно его качеством определяется чувствительность и специфичность конкретной тест-системы, поэтому для сравнения в ИФА нами были получены и испытаны лизатные антигены хламидий штамма "Ростиново-70". В качестве детергентов мы использовали: 0,1%-ный раствор додецилсульфата натрия, 1%-ный раствор дезоксихолата натрия, 1%-ный раствор твина-80, 1%-ный раствор тритона-ХЮО, также нами была разработана оригинальная схема очистки и концентрации лизированных антигенов хламидий.

Наиболее специфичным оказался антиген, полученный из фракции собранной в 35%-ной сахарозе ступенчатого градиента, которая подвергалась обработке 1%-ным дезоксихолатом натрия. Коэффициент его специфичности в ИФА при концентрации 6 мкг/мл составлял для сывороток кошек 10,6, собак -11,8.

Полученный антиген не реагировал с гетерологичными сыворотками, содержащими антитела против микоплазам и вирусов чумы плотоядных.

Хламидийные сыворотки получали на клинически здоровых серонега-тивных беспородных собаках и кошках. В качестве антигена для иммунизации мы использовали смесь хламидий штаммов "КС-93" и "КК-99". Интервалы между введениями антигенов составляли 14-15 дней. Все полученные иммунные хламидийные сыворотки сводили в серию с таким расчетом, чтобы специфическая активность приготовленной серии сыворотки была в РСК не ниже, чем 1:40. Контрольные (отрицательные) сыворотки получали от серонегативных интактных собак и кошек. Их обработку проводили аналогично схеме получения положительных сывороток. Контрольные (отрицательные) сыворотки также объединяли в одну серию.

В качестве конъюгата мы использовали белок А, меченный пероксидазой хрена (НПО "Пептоскрин-2", г. Электросталь). Титр конъюгата определяли путем "шахматного" титрования специфического антигена и положительных хламидийных сывороток.

Кроме того, нами был подобран регламента постановки реакции. При этом мы учитывали, что иммуноферментная тест-система относится к экспрессным методам диагностики, т.е. экспозиция реагентов должна быть наименьшей. Кроме того, чрезмерное увеличение времени инкубации планшете с реагентами в термостате часто приводит к снижению коэффициента специфичности тест-системы. В тоже время мы учитывали, что короткая экспозиция приводит к появлению ложноотрицательных результатов. Оптимальным временем экспозиции сывороток оказалась инкубация планшета в термостате в течение 60 минут, конъюгата — 40 минут. Полученные нами результаты согласуются с данными полученными исследователями, которые также разрабатывали иммуноферментные тест-системы для выявления специфических антител (6, 7).

В результате исследований нами разработан набор для диагностики хламидиоза собак и кошек в ИФА путем выявления антител, включающий: сорбированный специфическим хламидийным антигеном планшет для иммунологических реакций; положительные и отрицательные контрольные образцы сывороток крови собак и кошек; конъюгат; концентрат фосфатно-солевого раствора с твином; цитратный буферный раствор с перекисью водорода; хромоген и стоп-реагент.

ИФА с использованием этой тест-системы выполняется по непрямому методу:

— планшет или необходимое количество стрипов разборного планшета один раз промывают раствором ФСР-Т;

— контрольные и исследуемые образцы разводят в растворе ФСР-Т 1:100 и вносят по 100 мкл в лунку (контрольные образцы вносят каждый в 2 лунки);

— в одну лунку не вносят ни контрольные, ни исследуемые сыворотки (контроль конъюгата);

— планшет или стрипы разборного планшета помещают во влажную камеру и инкубируют 60 минут при 37°С;

— лунки 4 раза промывают раствором ФСР-Т, остатки содержимого лунок удаляют легким постукиванием по 4-5 слоям фильтровальной бумаги;

— в каждую лунку планшета или стрипа разборного планшета вносят по 100 .> мкл рабочего раствора конъюгата, после чего планшет или стрипы помещают во влажную камеру и инкубируют 40 минут при температуре 37°С;

— лунки 5 раз промывают раствором ФСР-Т, остатки содержимого лунок удаляют легким постукиванием по 4-5 слоям фильтровальной бумаги;

— в каждую лунку планшета или стрипа вносят по 100 мкл субстратного раствора и инкубируют при комнатной температуре в темном месте в течение 10-15 минут;

— реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл стоп-реагента и проводят учет результатов ИФА.

Результаты ИФА мы регистрировали с помощью спектрофотометра Mul-tiskan, измеряя оптическую плотность (ОП) смеси реагентов в лунках при длине волны 492 нм. «0» (бланк) устанавливали по воздуху. Результат подлежал учету, если среднее значение ОП отрицательных контрблей (ОП ср. К-) не превышало 0,2 оптические единицы (о.е.), а среднее значение ОП положительных контролей (ОП ср. К+) составляло не менее 0,8 о.е. Положительными считали образцы исследуемых сывороток, ОП которых превышала критическое значение ОП (ОП крит.), которое рассчитывали по формуле: ОП крит.= ОП ср. К- + 0,2.

Сконструированная нами тест-система имеет достаточно высокий коэффициент специфичности (6,5-7,5), что позволяет регистрировать результаты анализа не только инструментально, но и визуально по интенсивности окрашивания цветной реакции ферментзависимой метки с субстратом. Положительными считали образцы, интенсивность окрашивания которых в лунках с исследуемой сывороткой отчетливо отличалась от таковой в отрицательном контроле. Интенсивность окрашивания положительного контроля при этом должна была быть достаточно выраженной.

При определении критериев оценки результатов исследования сывороток крови подозрительных по заболеванию хламидиозом домашних плотоядных о, иммунопероксидазным методом мы учитывали обобщенные данные собственных исследований, а также анализировали сообщения по данному вопросу в доступной литературе. Нашими предыдущими (87) и настоящими исследованиями установлено, что для экспериментально и спонтанно зараженных хла-мидиями собак и кошек диагностическим титром является разведение сыворотки 1:100. Такой критерий оценки позволяет в наибольшей степени избежать получения как лоноположительных, так и ложноотрицательные результатов ИФА. Многие исследователи также указывают, что ИФА на порядок более чувствителен, чем РСК (1, 36, 126, 127, 128, 130, 203, 270). Исходя из этих данных, диагностический титр иммунопероксидазного метода при индикации хламидийных антител должен составлять 1:100, т.к. в РСК положительным принят титр сыворотки 1:10.

В ИФА нами были исследованы 287 проб сывороток крови мелких домашних животных, из них 91 проба (31,7%) реагировала в диагностических титрах (1:100 и выше).

Сравнительное изучении эффективности использования РСК и ИФА для ретроспективной диагностики хламидиоза у собак и кошек показало, что совпадение результатов двух тестов отмечается в 80,1% случаев. Значение показателя "РСК отрицательно / ИФА положительно", равное 19,2% (при исследовании сывороток собак — 17,6%, кошек — 20,1%), говорит о более высокой чувствительности последней. При этом в ИФА отдельные полевые сыворотки реагировали в титре 1:1600, что говорит о высокой чувствительности теста при диагностике хламидиоза у собак и кошек. Представленные данные находятся в соответствии с результатами других исследователей (65, 229, 543, 569 и другие), которые также отмечали высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость ИФА, а также целый ряд преимуществ метода перед РСК (3, 130, 203, 270, 279 и другие).

Таким образом, нашими исследованиями установлена возможность применения реакции связывания комплемента и иммуноферментного анализа для ретроспективной серологической диагностики хламидиозов у домашних собак и кошек. При этом установлено, что использование в качестве диагностического теста ИФА более эффективно.

Разработанный и испытанный нами набор препаратов для выявления хламидийных антител в ИФА обеспечивал индикацию и идентификацию заболевания у спонтанно инфицированных домашних плотоядных. Кроме того, мы предлагаем использовать этот метод для оценки эффективности иммунитета при вакцинации против хламидиоза и серологического скрининга поголовья мелких домашних животных (собак и кошек).

В настоящее время не возможно представить борьбу с хламидийными инфекциями животных без применения иммуногенных препаратов. Получением вакцин активно занималась целая группа исследователей (47, 96, 109, 110, 111, 112, 117, 131, 152, 215,216, 223, 225, 239 и многие другие).

В нашей стране созданы и внедрены в ветеринарную практику вакцины против хламидиозов крупного и мелкого рогатого скота, свиней. В последние годы разработаны вакцины против хламидиозов пушных зверей, собак и кошек, однако их качество не всегда удовлетворяет требованиям ветеринарных специалистов.

Нами была проделана работа по разработке биопрепарата для профилактики хламидиоза плотоядных животных. Для этого была использована технология получения инактивированной эмульсионной вакцины, разработанная Хамадеевым Р.Х. с соавт. (ТУ 10-07-253-91).

Были подобраны: иммуногенные штаммы хламидий, выделенные от пушных зверей, собак и кошек; режимы их инактивации; эмульгаторы, дающие удобную для применения препарата консистенцию и не обладающие повышенной реактогенностью в организме. Проведены лабораторные и производственные испытания вакцины против хламидийных инфекций плотоядных животных.

Учитывая достаточную иммуногенность штаммов хламидий "БЛ-84", "ПП-87", "КС-93" и "КК-99" (соответственно возбудителей хламидиозов лисиц, песцов, собак и кошек), они были использованы при изготовлении вакцинного препарата.

По методу, описанному Хамадеевым Р.Х. с соавт. (108) получена биомасса вышеуказанных штаммов. Разработана схема очистки и концентрации элементарных телец хламидий путем дифференциального и на градиенте сахарозы центрифугирования. Получены гомогенная и инактивированная взвесь хламидий с высоким содержанием специфического антигена, пригодная для приготовления препарата.

На основе двух эмульгаторов: легкого минерального "вакцинного" масла, изготовленного на Ангарском нефтехимическом заводе (43% в конечном продукте) и безводного ланолина (7% в конечном продукте) получена вакцина, которая имела стабильную при длительном хранении сметанообразную консистенцию и при температуре 30-37°С легко набиралась в шприц и вводилась животным подкожно и внутримышечно. Применение указанного масляного адъ-юванта повышает иммуногенность вакцин против хламидиоза (109).

В условиях лаборатории было установлено, что полученная вакцина безвредна и стерильна; при подкожном и внутримышечном введении обеспечивает у 100% морских свинок формирование иммунитета.

При вакцинации белых мышей препарат защищал от внутрибрюшинного заражения штаммом "250" 83,3-86,7% лабораторных животных. Иммунизированных белых мышей заражали штаммом "250", т.к. его летальность для белых мышей при внутрибрюшинной контаминации составляет 100%, что облегчает учет иммуногенных свойств вакцинного препарата. Использование морских свинок и белых мышей для оценки соответственно антигенных свойств и им-муногенности противохламидийных биопрепаратов предлагали и другие исследователи (109, 206, 215).

Кроме того, антигенность вакцины против хламидиоза плотоядных животных изучалась в условиях лаборатории на собаках и кошках путем анализа сероконверсии у подопытных животных через 2 и 4 недели после введения биопрепарата. Было установлено, что однократная вакцинация вызывает у домашних плотоядных накопление в сыворотках крови хламидийных антител, выявляемых в РСК и ИФА. Через 4 недели после инъекции титры антител в РСК и ИФА составили при внутримышечном введении 1:10-1:80 и 1:1001:1600 соответственно у 100% животных. В этом плане наши результаты согласуются с данными других исследователей (3, 178). Аналогичная картина наблюдалась при изучении сероконверсии после вакцинации против лептоспиро-за (4).

Для оценки иммуногенности вакцинных препаратов, в том числе и против хламидиоза, наравне с серологическими методами и экспериментальным заражением, используют и гистологические исследования иммунокомпетент-ных органов привитых животных.

Проведенные исследования свидетельствовали, что микроморфологические изменения в органах животных разных видов не имели резких отличий.

При микроскопических исследованиях гистологических срезов, приготовленных из органов морских свинок, собак и кошек, иммунизированных инактивированной эмульсионной вакциной против хламидиоза плотоядных животных (ВНИВИ), были обнаружены потоморфологические изменения, которые свидетельствували, что данный биопрепарат оказывает достаточно выраженное иммунологическое действие на организм, что подтверждается выраженными лимфоидно-гиперпластическими процессами в иммунокомпетентных органах.

Кроме того, мы отмечаем, что вакцина обладает и умеренными реакто-генными свойствами, которые вполне допустимы и не приводят к развитию необратимых процессов в органах и тканях иммунизированных животных.

С целью сравнительного изучения эффективности отечественных биопрепаратов против хламидиоза кошек и собак в условиях лаборатории нами была проведена иммунизация котят 3-4 месячного возраста и щенят 2,5-4 месячного отечественных противохламидийными биопрепаратами для мелких домашних животных: ассоцированной вакциной "Мультифел-4" против пан-лейкопении, калицивироза, гервесвироза и хламидиоза кошек (НПО "Нарвак"), вакциной против хламидиоза пушных зверей, собак и кошек "Хламикон" (ЗАО "Ветзвероцентр") и вакциной против хламидиоза плотоядных животных (ВНИВИ).

Нами установлено, что титры хламидийных антител у подопытных котят после введения вакцины против хламидиоза плотоядных животных (ВНИВИ) были несколько выше, чем после применения "Мультифел-4", однако эти показатели отличались недостоверно (Р>0,1). У групп котят и щенков, вакцинированных вакциной "Хламикон" уровень специфических антител был достоверно

102 ниже такового после иммунизации вакциной против хламидиоза плотоядных животных (ВНИВИ).

При испытании опытной серии вакцины в условиях ветеринарной клиники мы провели иммунизацию собак и кошек, содержащихся в домашних условиях. Было вакцинировано 24 собаки и 32 кошки. Препарат вводили однократно внутримышечно в дозе 0,5 мл с массой тела до 10 кг и однократно внутримышечно в дозе 1 мл с массой тела свыше 10 кг. Исследование сывороток крови иммунизированных животных спустя 30 дней после вакцинации показало высокую иммуногенность биопрепарата.

В заключение следует подчеркнуть, что проведенные нами исследования позволили: установить распространение хламидийных инфекций среди домашних плотоядных животных; усовершенствовать средства и методы диагностики хламидиоза у собак и кошек; разработать вакцину для профилактики заболевания у плотоядных животных и доказать её эффективность.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2002 года, Шамсутдинова, Нажия Вагизовна

1. Багдонас И.И. Тамашаускене Б.И. Внутрикожная проба ? как диагностический тест хламидийной пневмонии телят / Матер, конф. "Вопр. групп, профилактики заболеваний животных и птиц". Вильнюс, 1986. — С.39-40.

2. Багдонас И.И. Тамашаускене Б.И. Внутрикожная проба — как диагностический тест хламидийных пневмоний телят / Тезисы докладов Межреспубликанской конференции: "Вопр. групп, профилактики заболеваний животных и птиц". Вильнюс, 1987. — С.39-40.

3. Белов А.Д. Данилов Е.П. Дукур И.И. и др. Болезни собак. М. Агро-промиздат, 1990. — 368с.

4. Белоусов В.И. Клюкина В.И. Елисеев А.К. Кочиш И.И. Получение компонентов ИФА для выявления специфических антител к лептоспирам, сальмонеллам, кампилобактериям и хламидиям / Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. — С.74.

5. Белоусов В.И. Клюкина В.И. Кочиш И.И. Разработка набора для иммуноферментной серодиагностики хламидиоза овец / Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. — С.76.

6. Бескина С.Р. Панкратова В.Н. Попов В.П. Индикация антигенов гальпро-вий (хламидий) иммунопероксидазным методом / Сб. науч. тр. Экология вирусов. Баку, 1976. — С.208-209.

7. Боровик Р.В. Хамадеев Р.Х. Гаффаров Х.З. Шафикова Р.А. Получение антигена энзоотического аборта овец с помощью РСК // Ветеринария. -1975. №6. — С.51-53.

8. Борисенко К.К. и другие. Диагностика, лечение и профилактика заболеваний, передаваемых половым путем. Методический материал. — М. Асс. «Сенам», 1997.-С. 53.

9. Бортничук В.А. Попович Г.Г. Выделение хламидий от сельскохозяйственных животных и их идентификация // Микробиол. журн. 1981. — Т. 43. — № 2. — С. 183-187.

10. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней. Киев: Урожай, 1991. — 192с.

11. Брагина Е.Е. Дмитрйев Г.А. Морфологическое обоснование персистент-ного или латентного течения урогенитального хламидиоза / Тез. докл. Рос. съезда дерматол. и венерол. Казань, 1996. — С.106.

12. Бутин B.C. Тарасова Э.К. Сосновская А.И. Эпизоотология болезней сельскохозяйственных животных. Новосибирск, 1983. — С.74-76.

13. Ветеринарное Законодательство. Под общей редакцией Третьякова А.Д. // М. «Агропромиздат», 1989.-Т-4. С.391.

14. Вишняков И.Ф. Цыбанова Л.Я. Молчанова Т.В. Шшуноферментный анализ при диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных / Вопр. вет. вирусол. эпиз. и микроб. Тез. докл. научн. конф. Покров, 1983. — С.66-76.

15. Вишнякова Л.А. Иммунология орнитоза: Автореф. дис. докт. мед. наук. Ленинград, 1974. — 33с.

16. Вустина У.Д. Воробьёва В.Я. Источники инфекции клеточных пушных зверей / Экспресс-информация Казахского НИИНТИ. Алма-Ата, 1979. -С.1-10.

17. Вяянанян П. Диагностика хламидийных инфекций / В. сб. Диагностика и лечение хламидийных инфекций. М. 1987. — С. 18-21.

18. Гаффаров Х.З. Выделение вируса из группы пситтакоза-лимфогранулемы от телят, больных бронхопневмонией / Ученые записки КВИ. 1969. — № 104. -С.47.

19. Гаффаров Х.З. Хамадеев Р.Х. Шафикова Р.А. и др. Итоги широкого производственного испытания диагностикума хламидийного аборта овец / Болезни овец и меры борьбы с ними: Тез. докл. Всесоюз. конф. Чита, 1980.-С.33-36.

20. Гольдин Р.Б. Красник Ф.И. Применение флуоресцирующих антител для обнаружения вируса орнитоза // Вопр. мед. вирусол. 1964. — №10. — С.55-62.

21. Горовиц Э.С. Тимашева О.А. Использование реакции непрямой гемагг-лютинации для изучения орнитозной инфекции // Ж. Микробиол. 1976. -№ 12. — С.120-124.

22. Горовиц Э.С. Тимашева О.А. Использование РИГА для изучения орнитозной инфекции // Ж. Микробиол. эпидемиология и иммунобиология.-1978.-№2.-С.68-71.

23. Горовиц Э.С. Тимашева О. А. Катаева Г.В. Разработка и применение эрит-роцитарного диагностикума для выявления хламидийных инфекций усельскохозяйственных животных с помощью реакции гемагглютинации // Тез. докл. всесоюзн. конф. М. 1978. — С.47-49.

24. Горовиц Э.С. Тимашева О.А. Использование реакции непрямой гемагглютинации при изучении орнитозной инфекции // Ж. Микробиол. эпидемиология и иммунобиология. 1979. — № 3. — С. 108-112.

25. Горовиц Э.С. Тимашева О.А. Использование иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации для изучения орнитозной инфекции // Ж. Микробиол. эпидемиология и иммунобиология. 1981. — №9. — С.67-70.

26. Горовиц Э.С. Федоров В.Г. Елькин В.Д. и др. Выявление иммунологических сдвигов к хламидиям у больных с урогенитальной патологией // Ж. Микробиол. эпидемиология и иммунобиология. 1984. — №2. — С.89-91.

27. Громыко Л.Г. Терских И.И. Обнаружение и локализация антигена возбудителя орнитоза и трахомы в клетке // Вопр. вирусол. 1966. — №4. — С.95-99.

28. Громыко Л.Г. Терских И.И. Применение иммуноферментного метода (ELISA) при хламидийных инфекциях // Вопр. вирусол. 1981. — № 2. -С.245-248.

29. Гуненков В.В. Шарабрин О.И. Коромыслов И.Г. Диагностика иммуно-ферментным методом короновирусной инфекции крупного рогатого скота //Вестн. с/х науки. 1985. — № 11. — С. 122-124.

30. Домейка М.А. ELISA для индикации антител и антигена хламидий энтерита и пневмоний телят // Бюлл. ВНИИ экспер. вет. 1985. — № 58. — С.58-61.

31. Домейка М.А. Абрамова Л.Н. Мальцева Н.Н. Терских И.И. Использование иммуноферментного метода для исследований антихламидийных сывороток // Вопр. вирусол. 1985. — № 4. — С.474.

32. Домейка M.A. Биологическая характеристика хламидий возбудителя энзоотического энтерита телят. Автореф. дис. канд. вет. наук. — Тарту, 1986. -25с.

33. Домейка М.А. Терских И.И. Применение реакции ELISA для индикации антител и антигена хламидий энтерита и пневмонии телят / Вопр. груп. профилакт.заболеваний животных и птиц: Тез. докл. Межресп. конф. -Вильнюс, 1987.-С. 46-48.

34. Евдокимова Н.С. Выделение возбудителя орнитоза методами вирусолог, исследований / Материалы 45-й Научн. конф. мед. ин-та. Вып.2. — Алма-Ата, 1976. — С.27-29.

35. Евстифеев В.В. Хамадеев Р.Х. Хусаинов Ф.М. Равилов А.З. Выявление хламидийных антител и антигенов в РИГА / Матер. Междунар. науч. конф. посв.125-летию академии. Казань, 1998. — Ч. 1. — С.37-38.

36. Ильинский Ю.А. Орнитоз. Клиника, диагностика, лечение. М. Медицина. — 1974.

37. Ильинский Ю.А. Воробьева В.В. Горовиц Э.С. Тимашева О.А. Уровень спецефической сенсибилизации у больных орнитозом // Матер, всесоюзн. конф. Львов, 1988. — С.123-124.

38. Караваев Ю.Д. Дзиова Н.Н. Крюков Н.Н. Сравнительное изучение чувствительности РСК и микроагглютинации при диагностике энзоотического аборта овец // Бюлл. ВИЭВ. 1971. — Ч. И. — С.77-78

39. Караваев Ю.Д. Агглютинирующая активность штаммов возбудителя, выделенных при массовых абортах овец // Бюлл. ВИЭВ. 1972. — № 14. С.62-63.

40. Караваев М.А. Шаткин А.А. МакароваМ.А. и др. Профилактика и меры борьбы с болезнями овец. Махачкала ,1973.-С. 150-152.

41. Караваев Ю.Д. Налетов Н.И. Вакцинопрофилактика хламидиозного аборта овец / Тр. ВИЭВ. 1981. — № 53. — С.95-102.

42. Караваев Ю.Д. Исатаева Ш.И. Налетов Н.И. Сравнительное изучение РСК, РНГА и РНИФ при диагностике хламидиозного аборта овец // Бюлл. ВНИИ экспер. вет. 1986. — № 62. — С.14-18.

43. Караваев Ю.Д. Хламидиозный аборт овец (этиология, диагностика, специфическая профилактика). Автореф. дис. докт. вет. наук. М. 1987. -39с (ДСП).

44. Караваев Ю.Д. Налетов Н.И. Калугина И. Хламидиозы меры борьбы и профилактики // Ветеринарная газета. — 1993. — № 26. — С.4.

45. Ковалев В.Л. Схема выделения хламидий от животных / Труды Тадж. НИВИ. Душанбе, 1077. — Т.7. — С.11-14.

46. Ковалев В.Л. Андреева Р.Х. Степанова С.Н. Дикие животные резервен-ты возбудителей хламидиозов / Вопросы природ, очаговости болезней. -1978.-№9.-С.138-143.

47. Ковалев В.Л. Андреева Р.Х. Экспериментальный хламидиоз собак / Тр. ТаджНИВИ. Душанбе, 1979. — Т. 9. — С.9-14.

48. Колкова Н.И. Мартынова В.Р. К вопросам диагностики хламидийных инфекций//Ж. Клин. Лаб. диагн. 1998. — № 2. — С.20-21.

49. Кравченко Т.Ф. Серологическая диагностика при хламидиозе свиней / Матер. Всесоюзн.конф. Эпизоотол. эпидемиол. средства диагн. терапии и спец.профил.инф.бол. общих для чел. и жив. Львов, 1988. — С.114-115.

50. Кузьменко В.П. Особенности взаимодействия хламидий с клетками //Микробиол.журнал.-1980.-№2.-С.250-259.

51. Курбанов И.А. Попова О.М. Терских И.И. Гизатуллин Х.Г. Возбудители группы OJ1T в этиологии абортов коров // Ветеринария. 1973. — № 7. -С .36-39.

52. Кутлин А.В. Шаткин А.А. Дробышевская Э.И. Иммунодиагностические препараты на основе моноклональных антител к Chi.trachomatis // Ж. Мик-робиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1996. — № 6. — С.42-44.

53. Манолов А.Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии // Ж. Микро-биол. эпидемиол. и иммунобиол. 1985. — № 4. — С.100-107.

54. Мартынова Р.В. Шаткин А.А. Щербакова Н.И. Диагностическое выделение гальпровий (хламидий) в куриных эмбрионах при трахоме, паратра-хоме и другой этиологически родственной патологии / Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. М. 1979. — С.36-40.

55. Мартынова Р.В. Колкова Н.И. Шаткин А.А. Хламидии и хламидиозы: клиника, биология и диагностика // Рос. мед. вести. 1997. — Т.2. — № 3. -С.49-55.

56. Матвеев Л.В. Болезни собак и кошек. Н. Новгород, 1997. — 400с.

57. Медицинская микробиология / Под редакцией Покровского В.И. Поздеева O.K. М. ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999 г.

58. Митрофанов П.М. Меры борьбы с хламидиозом крупного рогатого скота // Ветеринария. 1980. — № 10. — С.33-34.

59. Мникова Л.А. Авилов А.С. Гоголев М.М. Применение иммунофермент-ного анализа в диагностике ротавирусной инфекции крупного рогатого скота// Бюлл. ВНИИ экспер. вет. 1985. — № 58. — С.26-29.

60. Мошковский Ш.Д. Природа вирусов и их место в системе живого // Вестн. АМН СССР. 1963. — Т.1. — С.37-39.

61. Муравьева Т.В. Применение метода флуоресцирующих антител для диагностики некоторых вирусных заболеваний глаз (трахома, паратрахома, герпес ). Автореф. дис.канд. мед. наук. М. 1968. — 22 с.

62. Непоклонова И.В. Васильев А.В. ИФА для выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и антител к нему // Бюлл. ВНИИ экспер. вет. 1985. — № 58. — С.30-35.

63. Николаева А.В. Об энзоотической пневмонии свиней, вызываемой вирусом из группы орнитоза лимфогранулемы — трахомы / Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Матер. I Межвузовской вет. вирусол. конф.-М. 1970. — с.227-228.

64. Новохатский А.С. Носик Д.Н. Литвинович Н.Е. Малахова И.В. Иммуно-ферментный анализ моноклональных антител на твердой фазе инфицированных клеток // Вопр. вирусол. 1986. — № 4. — С.440-444.

65. Обухов И.Л. Хламидиоз кошек. Приложение к журналу «Новости звероводства». М. 1994. — 92 с.

66. Обухов И.Л. Обнаружение Chi. psittaci при конъюнктивитах у собак / Сб. науч. тр. Всерос. ГНИИ контроля стандартизации и сертификации вет.препаратов. 1996. — Т.57. — С.45-51.

67. Обухов И.А. Хламидийные инфекции животных и птиц // Ветеринария. -1996. -№ 10. С. 19-26.

68. Обухов И.Л. Диагностика хламидийной инфекции у кошек // Ветеринария. 1997. -№5. -С.49-50.

69. Обухов И.Л. Молекулярный механизм паразитизма хламидий и их внутриклеточное развитие // С/х биол. Сер. Биол.животных. 1997. — № 2. — С.86-98.

70. Обухов И.Л. Груздев К.Н. Панин А.Н. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях // Ж. Ветеринария. 1997.-№ 2. — С.24-27.

71. Обухов И.Л. Яковенко М.В. Разработка праймеров для детекции хламидий // Ж. Ветеринария. 2000. — №5. — С.22-23.

72. Овчинников М.Н. Дилекторский В.В. Ультратсруктура возбудителей венерических заболеваний и ее клиническое значение. М. Медицина, 1986. -С.175.

73. Осидзе Д.Ф. Неориккетсиозы / Малоизвестные заразн. болезни жив. М. 1973. -С.164-183.

74. Попов B.JI. Бескина С.Р. Шаткин А.А. Электронно-микроскопическое определение локализации группоспецифического антигена гальпровий (хламидий) прямым иммунопероксидазным методом // ЖМЭИ. 1976. — № 12. -С.70-73.

75. Попов B.JL, Бескина С.Р. Панкратова В.Н. Иммунологические методы диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных / XXII Всемирный вет. конгр. Резюме (доклады и сообщения). М. 1979. — Т.З. — С.53-57.

76. Попов B.JI. Цикл развития и клеточный цикл и хламидий / Хламидии (гальпровии) и хламидиозы. М. 1982. — С. 16-17.

77. Попович Г.Г.Изучение антигенов полученных при помощи ультразвуковой дезинтеграции из* хламидий, в перекрестных РСК // Микробиол. журн. 1978. — Т. 40. — №4. — С.477-479.

78. Попович Г.Г. Антигенные свойства хламидий разного происхождения // Ж. Микробиол. 1978. — № 1. — С.69-72.

79. Попович Г.Г. Оценка серологических методов диагностики хламидиозов // Микробиол. журн. 1981. — Т.43. — № 2. — С.188-192.

80. Равилов Р.Х. Хамадеев Р.Х. Алимов A.M. Рекомендации по диагностике, профилактике и лечению хламидиоза домашних плотоядных животных, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 18 сентября 1998 г.-5с. (5/3).

81. Равилов Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных. Автореф. дис. докт. вет. наук. — Казань, 1999. — 28с.

82. Равилов Р.Х. Хламидиоз пушных зверей, собак и кошек. / Материалы VIII международного конгресса по ветеринарной медицине мелких домашних животных. М. 2000. — С. 214-216.

83. Равилов Р.Х. Гаффаров Х.З. Хамадеев Р.Х. Современные методы диагностики хламидиозов животных и птиц // Ж. Ветеринарный врач. №3. -2000.-С. 40-52. (12/4).

84. Равилов Р.Х. Диагностика, профилактика и лечение хламидиоза собак и кошек. / Ученые записки КГАВМ. Казань, 2002. — С. 49-57.

85. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней / Под. ред. В.И. Покровского. М. 1993. т.1: 357-366.

86. Ременцова М.М. Постричева О.В. Рыбалко С.И. Антропозоонозы в звероводческих хозяйствах. Алма-Ата: Наука, 1983.

87. Сайдуллин Т.С. Статистическая обработка результатов серологических исследований //Ветеринария. 1981. — № 7. — С.62-64.

88. Сербезов В. Огнянов Д. Матова Б. Выявление вируса орнитоза методом флуоресцирующих антител при помощи сывороток овец, содержащих антитела к вирусному аборту // Ж. гигиены, эпидемиол. микробиол. имму-нолог.-1965.-9.-№2.-С. 225-227.

89. Терских И.И. Орнитоз в СССР. Автореф. дис. докт. мед. наук. — М. 1957.

90. Терских И.И. Возбудитель орнитоза и другие представители хламидиоза // Вестн. АМН СССР. 1964. — № 3. — С.67-78.

91. Терских И.И. Громыко А.И. Вопросы патогенеза и механизм заражения при орнитозе //Вопр. мед.вирусол. Вып.Х. — 1964. — С.71-76.

92. Терских И.И. Беклешова А.Ю. Попова О.М. Культивирование вируса ор-нитоза в культуре клеток и приготовление тканевого диагностикума для кожной пробы // Вопр. мет. вирусол. 1964. — № 10. — С.95-100.

93. Терских И.И. Курбанов И.А. Об этиологии аборта коров / Акт. вопр. вет. вирусол. М. 1967. — С.28.

94. Терских И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции. М. Медицина, 1979.

95. Токаревич К.Н. Опыт серодиагностики орнитозной инфекции при помощи флуоресцентного метода // Научн. труды Ленинградского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. 1963. — Т. 25.-С.245-250.

96. Умнова Н.С. Желудков М.М. Павлова И.П. Шаханина К.Л. Выявление антигенов возбудителя бруцеллеза иммуноферментным методом // Ж. микробиол. эпидем. и иммунобиол. 1987. — № 9. — С. 103-107.

97. Фраткин В.А. Реакция нейтрофилов крови как показатель инфекционной и лекарственной аллергии // Сов. медицина. 1962. — № 9. — С.41-43.

98. Хазипов Н.З. Тюрикова Р.П. Нуруллин А.А. Метод твердофазного анализа для выявления туберкулезных микобактерий в суспензиях / Диагн. профилакт. и методы борьбы с туберкулезом животных. Казань, 1985. -С.98-101.

99. Хамадеев Р.Х. Изучение энзоотического аборта овец в Татарской АССР и усовершенствование методов лабораторной диагностики этого заболевания: Автореф. дис. канд. вет.наук. Казань, 1975. — 26с.

100. Хамадеев Р.Х. Методы лабораторной диагностики / Хламидиозы сельскохозяйственных животных. М. Колос, 1984. — С. 152-192.

101. Хамадеев Р.Х. Гаффаров Х.З. Равилов А.З. Способ получения концентрированной биомассы хламидий: Авт. свид. № 1460786. 1988.

102. Хамадеев Р.Х. Хламидиозы рогатого скота и свиней. Автореф. дис. докт. вет. наук. — Казань, 1991. — 40с.

103. Хамадеев Р.Х. Равилов А.З. Хусаинов Ф.М. Итоги'производственных испытаний вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота / Тез. докл.науч.практ.конф. по проблемам ветер, и животновод. Казань, 1994. -С.26-27.

104. Хамадеев Р.Х. Хусаинов Ф.М. Равилов А.З. Разработка и испытание по-лиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота / Тез. докл.науч.-практ.конф.по проблемам ветер, и животноводства. Казань, 1994. — С 28-29.

105. Хамадеев Р.Х. Хусаинов Ф.М. Равилов А.З. Разработка инактивирован-ной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней // Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. — С.151.

106. Хамадеев Р.Х. Гумеров В.Г. Угрюмова B.C. и др. Разработка ассоциированной вакцины против парагриппа-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота / Тез. докл.респ.науч.-практ.конф. по актуальным вопр.ветерин. и зоотехнии. Казань, 1996. — С.53.

107. Хамадеев Р.Х. Хусаиов Ф.М. Оценка эффективности полиштаммовой вакцины против хламидйоза крупного рогатого скота в производственных условиях / Тез. докл.респ.науч.-произв.конф. по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. Казань, 1996. — С. 51.

108. Хамадеев Р.Х. Хусаинов Ф.М. Равилов А.З. Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота // Ветеринария. 1996. — № 6. — С.22-24.

109. Хамадеев Р.Х. Равилов А.З. Возбудители хламидиозов сельскохозяйственных животных и их патогенность для человека // Журн. микробиол. -1997. -№ 1. С.99-101.

110. Хамадеев Р.Х. Хусаинов Ф.М. Равилов А.З. Магзянов Ф.З. Евстифеев В.В. Профилактика хламидиоза в условиях промышленного свиноводства / Матер. Межд. науч. конф. посвящ.125-летию Казанской вет. академии. -Казань, 1998. 4.1. — С.99-100.

111. Хисматуллина Н.А. Зуева Н.Я. Бусыгин К.Ф. Юсупов Р.Х. Новошинов Г.П. Диагностический препарат для иммуноферментного анализа антигена вируса бешенства / Актуальн. пробл. вирусол. Тез. докл. конф. М. 1985. — С.174.

112. Хламидиоз (клиника, диагностика, лечение): Методические рекомендации /Под ред. Серова В.Н. Краснопольского В.И. Делекторского В.В. и др. -М. Патент, 1999. 22с.

113. Хламидиозы сельскохозяйственных животных / Под ред. Хазипова Н.З. и Равилова А.З. М. Колос. — 1984. — 223с.

114. Хусаинов Ф.М. Хамадеев Р.Х. Равилов А.З. Хисматуллина Н.А. Использование иммуноферментного анализа для диагностики хламидиоза свиней / Вирусн. болезни с/ животных. Владимир. 1995. — С.67.

115. Червонский В.И. Попова О.М. Антиген для реакции связывания комплемента при орнитозе-пситтакозе // Вопр. вирусол. 1959. — № 1.

116. Ш6$кйк А.А. Бескина Р.С. Панкратова В.Н. и др. Индикация антигенов гальпровий (хламидий) прямым иммунопероксидазным методом // Ж. Микроб. эпидемиол.* иммунол. 1976. — № 9. — С.74-78.

117. Шаткин А.А. Гальпровии (хламидии) и вызываемая ими патология // Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. М. 1979. — Вып.1. -С.5-12.

118. Шаткин А.А. Основные принципы лабораторной диагностики гальпровио-зов (хламидиозов) / Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. -М. 1979.-Вып.1.-С.25-36.

119. Шафикова Р.А. Гаффаров Х.З. Равилов А.З. Выявление антител к возбудителю хламидиозного аборта овец в РЭМА / Сб. науч.тр. КВИ: Актуал. вопр.инф.патол.в промышл.животн. Казань, 1987. — С.35-40.

120. Шафикова Р.А. Гаффаров Х.З. Равилов А.З. Диагностика эпизоотического аборта овец реакцией энзиммеченных антител / Науч. основы технол. ипромыш. произв. вет. биол. преп. Тез. докл. III Всесоюзн. конф. М. 1987.- С.204-206.

121. Шафикова Р.А. Равилов А.З. Гаффаров Х.З. Новое в диагностике хламидиозного аборта овец / Тез. докл. рес. науч.-произв. конф. Казань, 1989. -С.4.

122. Шафикова Р.А. Иммунобиологическая характеристика хламидий, усовершенствование методов и средств лабораторной диагностики хламидиозов.- Автореф. дис. докт. вет. наук. Казань, 1991. — 38с.

123. Щербань Г.П. Фирсова Г.Д. Хламидиоз свиней, меры борьбы с ним / Тез. докл. Всесоюзн. науч.-исслед. конф. Профилакт. желуд.-кишеч. и респир. болезн. свиней. 1978. — С.53-54.

124. Alexander E.R. Wang S.P. Grayston J.T. Father classification of TRIC agents from ocular trachoma and other sources by the mouse toxicity prevention test // Am. J. Ophthal. 1967. — N63. — P. 1469-1478.

125. Armstrong J.A. Valentine R.C. Filds C. Structure and replication of the trachoma agent in cell cultures, as shown by electromicroscopy // J. Gen. Microbiol. 1963. — N30. — P.59-73.

126. Babudieri B. The slide microagglutination tests in the field of Rickettsial and viral serology. Its Advantages and Limitations // Path. Microbiol. 1961. — N24. -P. 11-20.

127. Baker J.A. Comments in feline pneumonitis // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1971. -N214. -P.250-259.

128. Barron A.L. Collins A.R. Studies on trachoma agent by double diffusion gel precipitation //Amer. J. Ophthal. -1967. -63. -p. 1437/461-1491/465.

129. Barron A.L. Gaste P.G. Paul В. Page L.A. Detection of chlamydiae antibodies in animal sera by double diffusion in gel //Appl. Microbiol. -1972. -29, #4.-P.770-774.

130. Becker J. The Molecular Biology of Trachoma Agent // J. Isr. Med. 1972. -N8. — P.l 134-1137

131. Bedson S.P. Bland J.O. Morphological study of the psittacosis virus, with a description of the developmental cycle // Brit. J. Exp. Path. 1932. — N13. — P.461-466.

132. Bedson S.P Immunological studies with vims of psittacosis // Brit. J. Exp. Path. 1935.-N14.-P.165-170.

133. Bedson S.P The PVL group of viruses // Brit. Med. Bull. V.9. — N3. — P.226-230.

134. Beer I. Untersuchungen an und mit romplement bilden den Antigen des Vi-rusabortus Schafe // Zbl. Vet. Med. 1958. — V.5. — N4. — S.305-328.

135. Beer I. Der Virusabort des Schafes // Mh. Vet. Med. 1961. — V. 16. — N1. — P.l -5.

136. Beer J. Experimented Untersuchungen uber die Diagnostik der Virus-aborts der Schafe mit allergishen Intracutantesten // Arch. Exp. Veterinarmed. -1958.-12.-S. 384-391.

137. Belden E.L. Mckercher D.G. Passive hemagglutination test for bovine chlamydial abortion // Infec. and Immun. 1973. — 7. #2.-P. 141-146.

138. Benedict A.A.,0'brien E. Antigenic studies on the psittacosis-lymphogranuloma venereum group of viruses. II. Characterisation of complement fixing antigens extracted with sodium lauril sulfate //J. Immunol.-1956.-76,#4.-P.293-300.

139. Blanco L.A. Barrera P.J. Macrotegui M.A. Ultrastructura de una chlamydia de origen bovino // An. Inst Nac. Investig. Agr. Ser. Hig. Sanid anim. 1975. -N2. — P.37-55.

140. Bugdeman S. Teichert C. Ahlin A. et al. Influence of'storing urogenital specimens at 20° before testing by enzyme amplified immunoassay // Geniourin Med. 1989. — V.65, N2 — P 92-95.

141. Caldwell H.D. Kromhout J. Schachter J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chi. trachomatis // Infect. Immunol. 1981.-N31.-P.l 161-1176.

142. Caldwell H.D. Judd R.C. Structural analysis of chlamydial major outer membrane proteins // Infect. Immunol. 1982. — N38 — P.960-968.

143. Carbolos D.S. Jesus S. Francoise В. Armel S. Annie R. Protective immunity against Chi. psittaci serotype 1 strains // Infec. Dis. Obestet. and Gynecol. -1996. V.4. — N3 — P.197-198.

144. Cello R.M. Microbiological and immunologic aspects of feline pneumomitis // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1971. — N158. — P.932-938

145. Cevenini R. Rumpianesi F. Donati M. Sarov I. A rapid immunoperoxidase assay for the detection of specific IgG antinodies to Chlamydia trachomatis //J. Clin. Pathol. 1983. — 36, #3.-P.353-356.

146. Charton A. Chlamydioses des ruminants (bovine, ovine, caprine): etudes ex-perimentales. 2. Composition polypeptidique des corps elementaires de soches de diverses origines // Bull. Acad. Vet. Fr. 1976. — V.49. — N4. — P.401-408.

147. Chassey D. Davies P. Dawson M. Immunoperoxidase detection of chlamydia ovis in experimentally infected cell culture // Brit. Vet. J. 1981. — V. 13 7 — N6.- P.634-638.

148. Chiba N. Arikawa J. Takaschima I. Hashimoto N. Isolation and serological survey of chlamydioses in feral pigeons and crows in Horraido // Jap. J. Vet. Sc.- 1984. V.46 — N2. — P.243-245.

149. Christensen P.M. Nolkert M. Two complement fixing antigens from infected yolk sacs. II. The nature of the virus antigen and its relation to phosphatide antigen//Acta Path. Microbiol. Scand.- 1955.-V.37.-N.3.-P.219-224.

150. Christiansen G. Ostergaard L. Birkelund S. Molecular biology of the Chi. pneumoniae surface // Scand. J. Infect Dis. 1997. Suppl. N104. — p.5-10.

151. Colon J.I. The role of folic acid in the metabolism of members of the psittacosis group of microorganisms // Ann. N.Y. Acad. Sc. 1962. — N98. — P.243.

152. Cutlip R.S. Electron microscopy of cell cultures infected with a chlamydial agent causing polyartritis of lambs // Infect. Immunity. 1970. — N1. — P.499-502.

153. Darougar S. Dwyer R. Treharne J.D. et al. A comparison of laboratory methods of diagnosis of chlamydial infection // Excerpta Med. Amsterdam, 1971. -P.445-460.

154. Darougar S. Treharne J.D. Cell culture methods for the isolation of Chi. trachomatis. a review / Chlamydial infection Elsevier Biomedical Press, 1982. -P.265-274.

155. Dhingra P.N. Agarwal L.P. Mahajan V.M. et al. Chlamydia group antigen // Zbl. Vet.Med. 1981. -B.28. -N4. -P.336-340.

156. Dhir S.P. Kenny G.E. Grayston J.T. Characterization of the group antigen of Chi. trachomatis // Am. Soc. Microbiol. 1971. — V.4. -N6. — P.725-730.

157. Dhir S.P. Hakomori S. Kenny G.E. et al. Immunochemical studies on chlamydial group antigen // J. Immunol. 1972. — N109. — P. 116-122.

158. Doughri A.M. Storz J. Altera K.P. Mode of Chlamydia in infections of intestinal epithelial cells // J. Infect. Dis. 1972. — V.126. -P.652-657.

159. Duggan M.A. Pomponi C. Kay D. Robboy S.J. Infantile chlamydial conjunc-ticitis A comparison of Papanicolaon, Giemsa and immunoperoxidase staining methods // Acta cytol. -1986. -30, #4.- P.341-346.

160. Dwenger A. Radioimmunoassay: an overview // J. Clin Biochem. 1984. -V.22. -N12. -P.883-894.

161. Eissenberg L.G. Wyrick P.B. Davis C.H. Rumpp J.W.' Chi. psittaci elementary body envelopes: Ingestion and inhibition of phagolysosome fusion // Infect, and Immunol. 1983. — V.40. — N2. — P.741-751.

162. Engvall E. Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay for immunoglobulin G // J.Immunoch.-1971- N8- P. 871.

163. Erlandson R.A. Allen E.G. The ultrastructura of meningopneumonitis // Virology. 1964.-N22.-P.410-418.

164. Escalante O.C. Rivera F.A. Trigo T.F. Romero M.J. Detection of Chi. psittaci in enteric subclinical infections in adult sheep, through cell culture isolation // Rev. Latinoamer. Microbiol. 1996. — V.38. — N1. — P. 17-23.

165. Evans R.T. Chalmres W.S. Woolcock P.R. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of chlamydia antibody in duck sera // Avian Pathol. 1983. — V. 12. — N1. — P. 117-124.

166. Fames K. Richard D.F. Groft G.F. Johnson F.B. Evaluation of a cell culture-immunoperoxidase stain method for the diagnosis of chlamydia trachomatis infections // Abstr. Annu Veet Amer. Soc. Microbiol. 1986.- Washington D.C. 1986.

167. Farshy C.E. Barnes R.C. Detection of Chi. trachomatis inclusions in tissue culture by an antigen-capture sandwich ELISA / Abstr. Annu. Meet Am. Soc. Microbiol. Waschington, D.C. 1986.

168. Fedorko D.P. Clark R.B. Nachamkin I. Dalton H.P. Complement dependent in vitro neutralization of Chi. trachomatis by a subspecies-specific monoclonal antibody // Med. Microbiol, and Immunol. 1987. — V.176. -N4. — P.225-228.

169. Finney P.M. Bushell A.C. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for anti-chlamydial secretory immunoglobulin A in guinea pig tears // J. Immunol. Meth. 1986. — V.86. — N1. — P.71 -74.

170. Frazer G. Berman D.T. Typospecific antigens in the PLV group of organisms // J. Bact. 1965. -N89. -P.943-948.

171. Frei W. Eine Meue Hautreaktion bei Lumphogranuloma inguinale //Klin. Wo-chenschr.- 1925.- 4.-S. 2148-2149.

172. Friis R.R. Infection of L cells and Chi. psittaci, entry of the parasite and host responses to its development // J. Bacteriol. 1972. — V.l 10. -P.706-721.

173. Fukuchi H. Ogawa H. Ninamoto N. et al. Seroepidemiological surveillance of Chi. psittaci in cats and dogs in Japan // Vet.Res. 1985. — V.l 17. — N19. -P.503-504.

174. Gollins A.R. Barron A.L. Demonstration of Group- and Species-Specific Antigens of Chlamydial Agents by Gel Diffusion // J.Inf. Dis. -1970.-121, #1.- P.l-8.

175. Geally J.F. Monoclonal antibodies and their potential in medicine // Irish Med. J. 1987. — V.80. -N6. — P. 161-162.

176. Glynn A.A. Ison C. Enzyme immunoassay in Bacteriology / Immunoassays 80: Symp. Lancaster, 1981. — P.431-440.

177. Gordon F.E. Nichols R.L. Quan A.L. Trachoma and related disorders caused by chlamydial agents. -Excerpta-Medica, 1971. -P.358-362.

178. Hackstandt T. Identification and properties of chlamydial polypeptides that bind eucaryotic cell surface components // J. Bacteriol. 1986. — N165. — P.13-20.

179. Haskizume S. Diagnosis of chlamydial infection // Asian Med. J. 1988. -V.31. — N2. — P.83-86.

180. Hendrick J.C. Franchimont P. New trends in radioimmunoassay / Protid. Biol. Fluids. Oxford, 1974. — P.619-624.

181. Hewinson R.G. Griffith P.C. Rankin S.E.S. Towards a d: fferential polymerase chain reaction test for Chlamydia psittaci. Vet. Tec. 1991,128; 381-382

182. Higachi N. Electron microscopic studies on the trachoma virus and psittacosis virus in cellcultures // Ex. Mol. Pathol. 1965. — N4. — P.24-29.

183. Holland S.m. Gaydes C.A. Quinn T.C. Detection and di fferention of Chlamydia trachomatis, Chi. psittaci and Chi. pneumoniae by DNA amplification. J.Jnfect. Dis, 1990, 162:984-987.

184. Hunter W.M. Radioimmunoassay: Handbookof experimental immunology / Weir D.M. ed. Oxford: Blackwell Scient. Publ. 1978. — V.l. -N14. — P. 1-40.

185. Jeggo M.H. Diagnosis of viral diseases using ELISA techniques / Nucl. And Related Techn. Anim. Prod. And Health, Proc. Inf. Symp. Viena, 1986. -P.289-301.

186. Jenkin H.M. Preparation and properties of cell walls of agent of meningopneu-monitis // J. Bacteriol. 1960. — V.80. — P.639-647.

187. Jenkin H.M. Ross H.R. Moulder J.W. Spacies-specifie antigens from the cell walls of the agents of meningopneumonitis and foline pneumonitis //J.Immunol.-1961 .-86.-P. 123-127.

188. Jenkin H.M. Chlamydia: biology and experimental pathology / Charman's report and discussion: Nongonococcal urethritis and relat. infect. Washington, D.C. 1977. — P.233-234.

189. Johnson F.W.A. Glarksen M.J. Spencer W.N. Susceptibility of Chlamydia psittaci (ovis) to antimicrobial agents // J. Antimicrob. Chemother.-1983.-11,#5.-P.413-418.

190. Kaleta E.F. Aktuelle Fragen der Diagnose und Bekampfung der Psittakose // Tierarztl. Umsch. 1997. Jg.52. -Nl. — S.36-44.

191. Kaltenboeck В. Kousoulas K.G. Storz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction. J.Clin. Microbiol. 1991,29:1969-1975.

192. Kaltenboeck В. Kousoulas K.G. Stors J. Two-step Polymerase chain reactions and restriction endonuclcase analyses detect and differentiate ompADNA of Chlamydia spp. J.Clin. Microbiol. 1992,30:1098-1104.

193. Kingsbery D.T. Weiss E. Lack of DNA homology between species of the genus Chlamydia // J. Bacteriol. 1968. — V.96. -N4. — P. 1421-1423.

194. Kishimoto Т. Kobota Y. Matsumoto A. et al. // J. Jap. Assoc. Infect. Dis. -1996. V.70. — N8. — P.821 -829.

195. Kordova N. Wilt J.C. Martin C.E. The use of cell cultures from the chorioallantoic membrane of chick embryos for studies of chlamydiae // Can. J. Microbiol.- 1977.-23, #5. -P.624-626.

196. Krauss H. Diagnosis of chlamydia disease with particular reference to aheep // Ann. Proc. sheep. Vet Soc.-1985.-9.-P.73-78.

197. Kruger M. Wehr J. Zur Eignung verschidener Labortiere als Model zur Wirk-samkeitsprufung von Chlamydienimpfstoffen // Wiss. Wissenschaftiliche Zeitschrift. 1980. — V.29. -Nl. — P. 123-129.

198. Kuo C.C. Caldwell H.D. Wang S.P. Grayston J.T. Nongonococcal Urethritis and Related Infections.-Washington, DC. 1977.-P. 176-185.

199. Kuo C.C. Chi E.Y. Ultrastructural studies of Chi. trachomatis surface antigens by immunogold staining with monoclonal antibodies // Infect, and Immunol. -1987. V.55. -N5.-P.1324-1328.

200. Levy R.A. Waford A.L. Evaluation of the modified chlamydiazyme immunoassay for the detection of chlamydial antigen // Am. J. Clin. Pathol. 1986. -V.86. — N3. — P.330-335.

201. Lema F. Everaere S. Rougeot C. et al. ELISA for detection of human antibodies to Chlamydiae // J. Immunol. Meth. 1986. — V.94. -Nl-2. -P.153-159.

202. Lewis V.J. Thacker W.L. Engelman H.M. Indirect Hemagglutination Test for Chlamydial antibodies //App.Microbiol.-1972. -24, #l.-P.22-252

203. Litwin J. Officer J. Brawn A. Moulder S. A comparative study of the different cycle of different member of the psittacosis group in different host cells // J. Infect. Dis. 1961.-V.109.-N3.-P.251.

204. Maclean I.W. Peelino R.W. Brunham R.C. Characterization of Chi. trachomatis antigens with monoclonal antibodies // Can. J. Microbiol. 1988. — N34. -P.141-147.

205. Manire C.P. Tamura A. Preparation and chemical composition of the cell walls of nature infections dense forms of meningopneumonitis organisms // J. Bact. -1967. V.94. — N4. — P.l 178-1183.

206. Мартинов С. Попов Г. Вакцина против хламидщалён абортус Kaj овците // Македон. Вет. Прегл. 1993. Г.22. — Бр.1/2. — С.25-33.

207. Мс Ewen A.D. Foggie A. Enzootic abortion in ewes: Prolonged immunity following the injection of adjuvant vaccine // Am. J. Vet. Res. 1956. — V.68. -N40. — P.686-690.

208. Meinerhofer W.A. Frank F.W. Scrivner L. Ovine virus abortion // J. Am. Vet. Med. Ass. 1962.- V.140.-N5.-P.448-450.

209. Mendlowski В. Segre D. Purification of the virus ovine abortion and its use in agglutination test // Am. J. Vet. Res. 1963. — N25. — P.627-645.

210. Meyer K.F. Eddie В. Schachter J. Возбудители пситтакоза и венерической лимфогранулемы / Лаб. Диагн. вирус, и риккетсиозных забол. М. Медицина, 1974. — С.708-739.

211. Mields W. Hentchke J. Becker W. Teufel P. Die Immunoperoxidase-methode zum Nachweis von Virus-and Chlamydien-antigenen // Zbl. Vet. Med. B. -1974.-V.21.-S.48-58.

212. Mitscherlich E. Der Virusabort des Schofes in Deutschland // Dtsch. Tierarztl. Wsch. 1954. — N5. — S.42-46.

213. Mitscherlich E.Die Bekampfung des Virusabort der Schofes // Berl. und Munch. Tierarztl. Wochen. 1965. — B.78.-N5. — S.81.

214. Mitscherlich E. Die Bekampfung des Virusabort der Schofes // Zbl. Vet. Med. 1966. — В13. — N2. — S. 180-183.

215. Morland В. Byrne G.I. Jones T.C. The effect of ultracellular Chi. psittaci on Lysosomal enzyme activities in mouse peritoneal macrophages // Acta Path. Microbiol, et Immunol. Scand. 1987. — V.95. — N6. — P.291-293.

216. Morter R. Chlamydial diseases // Mod. Vet. Pract. 1981. — V.62. — N6. -P.467-468.

217. Moulder J.W. Биохимия внутриклеточного паразитизма. M. Мир, 1965. -197с.

218. Moulder J.W. Metabolic capabilities and deficiencies of rickettsiae and psittacosis group // Int. J. Leprosy. 1965. — V.33. — P.494.

219. Moulder J.W. Grissa D.L. Cho H.J. Endogenous metabolism of protein and ribonucleic acid in a member of the psittacosis group // J. Infect. Dis. 1965. -V.115. -N3. -P.254.

220. Moulder J.W. The contribution of model system to the studying of infections disease // Persp. Biol. Med. 1971. -N14. — P.486-502.

221. Moulder J.W. Levy N.J. Schulman L.P. Persistent infection of mouse fibroblasts (L-cell) with Chi. psittaci: evidence for a cryptic chlamydial from // Infect. and Immunol. 1980. — V.30. — N3. — P.874-883.

222. Murrey E.S. Guinea pig inclusion conjunctivitis virus. I. Isolation and identification as a member of the PLV group // J. Infect. Dis. 1964. -N114. P.1-12.

223. Nettleman M.D. Batteiger B.E. Wilde C.E. Jones R.B. Conservation of the major outer membrane protein of Chi. trachomatis within a serovar // Abstr. Ann. Meet Am. Soc. Microbiol. Washington, D.C. 1986. — P.92-96.

224. Nowell P. Phytohemagglutinin an initiator of mitoses in cultures of normal human leucocytes // Gancer. Res.-1960.-20.-P.462-470.

225. Огнянов Д. Симерджиев Б. Макавеева-Симонова Е. и др. Исследования на комплементсвъращи противотела срещу неориккетсии различии видове домашни животни // Вет. Мед. Науки. 1965. — T.l 1. — N4. — С.475-481.

226. Огнянов Д. Неориккетсиозите катозоонози // Вет. Сб. 1976. — Т.74. — N9. -С.12-15.

227. Ohana В. Prankratova V. Groh A. et al. Sero CT™-e new peptide based ELISA test for specific detection of Chi. trachomatis antibodies // Infect. Dis. Obstet. and Ginecol. 1996. — V.4.-N3.-P.192.

228. Ориэл Д.Д. Риджуей Д.Л. Хламидиоз. -М. Медицина, 1984. 191с.

229. Page L.A. Stimulation of cell mediated immunity to Chlamydiosis in Turkeys by inoculation of Chlamydial Bacterin // Am. J. Vet. Res. 1978. — V,39. -P.473-480.

230. Parker C.W. Radioimmunoassay of biologically active compounds. New Jersey: Prentice-Hall Inc. 1976.

231. Pearson T.W. Properties of the monoclonal antibodies produced by hybridoma technology and their application to the study of diseases. Geneva, 1982. -P.55-62.

232. Pepin M. Bailly L. Souriau A. Rodolakis A. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of chlamydial antibodies in caprine sera // Ann. Rech. Vet. 1985. — V.16. -N4. -P.393-398.

233. Perez-Martinez J.A. Storz I. Chlamydial infection in cattle. P.l // Mod. Vet. Pract. 1985. — V.66. — N8. — P.517-522.

234. Perez-Martinez J.A. Storz I. Chlamydial infection in cattle. P.2 // Mod. Vet. Pract 1985. — V.66. — N9. — P.603-608.

235. Petersen E.E. Chlamydien infektionen // MTA. 1996. — V.ll. — N5. -S.354,356-358,360,362.

236. Piriano F.F. Abel C. Plague assay for psittacosis virus in monolayers of chick embryo fibroblasts//J. Bacteriol. 1964.-N87.-P.1503-1511.

237. Poffenroth L. Costerton J.w. Kordova N. Wilt J.C. Ultrastructural studies of Chi. psittaci 6BC strains // Can. J. Microbiol. 1973. — V,19. — N8. — P.887-894.

238. Popovici V. Sotirin E. Cercetari serologica a supra avortului virotic al oilor // Inst. Patol. si Gigiena. Anim. 1963. -N12. -P.237-243.

239. Rake G. Viral and rickettsial diseases of the skin, eye and mucous membranes of man // Ann. N.Y. Acad. Sc. 1953. — V.56. — N3. — P.557-560.

240. Rank R.G. Barron A.L. Effect of antithymocyte serum on the course of chlamydial genital infection in female guinea pigs // Infec. and Immun.-1983.-41, #2.-P. 876-879.

241. Rasmussen S.J. Timms P. Detection Chlamidia psittaci usinq DNA probes and the polymerase chain reaction, REMS Microbiol. Jett. 1992,77:169-174.

242. Reed D.K. Lincoln S.D. Kwaplan R.P. et al. Comparison of antigenic structure and pathogenicity of bovine intestinal Chlamydia isolate with an agent of epizootic bovine// Am. J. Vet. Res. 1975. — V.36. -N8. — P. 1141-1143.

243. Reed L.F. Muench H. A simple method of counting 50% end-point // Am. J. Hygiene. 1938. — V.27. — P.493-497.

244. Riera M.C. Barron A.L. Reactions with Hemagglutinin of Psittacosis Agent in Gel Biffusion // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970.-135, #1 .-P.594-597.

245. Rodolakis A. Souriau A. Clinical evaluation of a commerical vaccine against chlamydial abortion of ewes // Ann. Rech. Vet.-1979.-10,-S.41-48.

246. Russo P. Giauffret A. Interet du test de transformation lymphoblactique pour le controle des vaccins chlamydiens // Rev. Med. Veter. -1978.-129, #6.-P.879-886.

247. Samoilovich S.R. Dugan C.B. Macario A.J.L Hybridoma technology: new developments of practical interest // J. Immunol. Meth. 1987. — V.101. — N2. -P.153-170.

248. Sardinia J. Ganem D. Outer membrane protein of Chi. trachomatis are devel-opmentally regulated // J. Cell Biochem. 1987. -B.II. — P.l 12-115.

249. Sarov J. Becker Y. Trachoma agent DNA // J. Mol. Biol. 1969. — N42. -P.581-584.

250. Schachter J. Storz J. Tarizzo M.L. Bodel K. Chlamydiae as agents of human and animal diseases // Bull. Wrld. Hlth. Org. 1973. — V.43. — P.443-449.

251. Schachter J. Banks J. Sugg N. et al. Serotyping of Chlamydia: isolates of bovine origin // Infect, and Immunol. 1975. — V.II. — N5. — P.905-907.

252. Schlossberger H. Kolle W. Hetsch H. Experimentelle Bakteriologie und Infek-tionskrankheiten Munchen, 1952.

253. Seki C. Takashima I. Arikawa J. Hashimoto N. Monoclonal antibodies to Chi. psittaci: characteristics and antigenic analysis // Jap. Vet. Sc. 1988. — V.50. -N2. -P.383-393.

254. Schmeer N. Adami M. Dopfer B. u.a. Zur humoralen Immunantwort von Ziegen, Kaninchen und Meerschweinchen hach der Vakzination mit einem Q-Fieber-Impfstoff // Berl. Munch. Tierarztl. Wschr. 1985. -N98. — S.20-24.

255. Schmeer N. Krauss H. Apel J. et al. Analysis of caprine IgGl and IgG2 subclass responses to Chi. psittaci infection and vaccination // Vet. Microbiol. -1987. V.14. — N2. — P.125-135.

256. Shewen P.E. Povey R.C. Wilson M.R. A survey of the conjunctival flora of clinically normal cats and cats with conjunctivitis // Can. Vet. J. 1980. -N21. -P.231-233.

257. Singh C.K. Dhingra P.N. Kumar N. Isolation of Chlamydia from cerebral tissue of buffalo calf// Curr. Sc. (India) 1989. — V.58. -N9. — P.500-502.

258. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. -N98. — P>503-517.

259. Stephens R.S. Kuo C.C. Chi. trachomatis species-specific epitope detected on mouse biovar outer membrane protein // Infect. Immunol. 1984. — N45. -P.790-791.

260. Sting R. Chlamydia-psittaci-Infektionen bei Kuhun und weiblichen Schafen im nordlichen Baden-Werttemberg // Tierarztl. Umsch. 1997. — Jg.52. — N6. -S.332-339.

261. Storz J. Superinfection of pregnant ewes latently infected with a psittacosis lymphogranuloma agent // Cornell Vet. 1963. -N53. — P.469-480.

262. Studdert M.J. Mokercher D. Bedsonia abortion of Sheep. III. Immunological Studies // Res. Vet. Sci.- 1968.-9. -P.331-336.

263. Terzin A.L. Matuka S. Fornazaric M.R. HXaca D.M. Preparation of group specific Bedsonia antigens for use in complement-fixation reaction // Acta Virol. 1961.-N5.-P.78-83.

264. Todd W.J. Caldwell H.D. The infection of Chi. trachomatis with host cell. Ultrastructural studies of the mechanism of release of biovar II stain from Hela 229 cells //J. Infect. Dis. 1985. — V. 151. — N6. — P.l 037-1044.

265. Travnicek M. Dravesky Т. Balascak J. Isolacia Chi. psittaci z abortovaneho plodu kravy // Vet. Med. (CSSR). 1984. — V.29. -N3. -P.133-136.

266. Urnovitz H.B. Gottfried T.D. Robinson D.J. Immunoassays for the detection of antibodies toChl. Trachomatis in the urine: Pat. 5516638 USA. 1996.

267. Van Weemen B.K. Schuurs A.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugete //FEBS Letters. 1971. — N15. — P.232-236.

268. Van Zaane D. Ijzerman J. Monoclonal antibodies against bovine immunoglobulins and their use in isotype-specific ELISAs for rotavirus antibody // J. Immunol. 1984. — V.72. -N2. — P.421-441.

269. Vitu C. Russo P. Giauffret A. Application du test ELISA a la serologie des chlamydioses des oviris et des caprine: Edu de comparative avec la reaction de fixation du complement // Bull. Lab. Vet. P 1984. N13. — P.55-69.

270. Wachendorfer C. Valder W.A. Luthgen W. Erfahrungen mit der Vakzination gegen den Chlamydienabort des Schafes // Wiss. Z.Humb. Univ. Berlin.-1980.-R.29.-S. 105-111.

271. Wang S.P. Grayston J.T. Trachoma and related disorders coused by chlamydial agents / Amsterdam, 1971. P.305-321.

272. Wang S.P. Kuo C.C. Barnes R.C. et al. Immunotyping of Chi. trachomatis with monoclonal antibodies // J. Infect. Dis. 1985. — V.152. -N4. — P.791-800.

273. Watkins N.G. Moos A.B. Caldwell H.D. A genus specific chlamydial antiden elicits ocular delayed hypersensitivity in immune guinea pigs // J.Cell. Bioch.-1987.-11B.-P.120-124.

274. Wilson M.K. Isolation of PLV group vims from the faeces of clinically normal cattle in Britain // Vet. Rec. 1968. — V.74. — N49. — P. 1430.

275. Yolken R.H. Monoclonal antibodies in microbiologic immunoassay // Lab. Manag. 1983. — V.21. -N9. — P.49-51, 54-55.

276. Zhang Y.X. Stewart S. Joseph T. et al. Protective monoclonal antibodies re-codnize epitopes located on the major outer membrane protein of Chi. trachomatis // J. Immunol. 1987. — V.138. -N2. — P.575-581.1. Ссылки на сайты Internet

277. Биологические свойства хламидий http://iaci. ru. /Ь/chool. htm. 22.11.2000.

278. Ямникова С.С. Федякина И.Т. Непоклонова И.В. Новая классификация*хламидий и их роль в заболевании мелких животных. Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. http://vet. webservis. ru./doc/.

279. Обухов И.Л. Шипулин Г.А. Груздев И.Н. Молекулярногенетический подход диагностики хламидиозов животных и птиц на основе полимеразной цепной реакции. http://www. per. ru. Bibliogr /27.10.00.

280. Ремцов А.П. Неверов В.А. Семенов Н.В. Хламидийные инфекции. Санкт-Петербург. 1995. http://vet. webservis. ru./doc/.

281. Хламидиоз: современные подходы в диагностике и лечение. http://www. Laborotoria.khv. ru./2001.

282. Хламидиоз кошек. http://Lpets-By-nm. ru/veteriny/09.12.01.

283. На основании приказа по Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана № 57 от 25 июня 2001 г. комиссия в составе:

284. Зав. каф. биохимии, профессор Хазипов Н.З. (председатель).

285. Зав. каф. микробиологии и вирусологии, профессор Госманов Р.Г.

286. Доцент каф. биохимии Якупов Т.Р.

287. Провела проверку пригодности "Тест-системы иммуноферментной для выявления хламидийных антител у собак и кошек", предложенной коллективом авторов Хамадеев Р.Х. Герасимов В.В. Равилов Р.Х, Шамсутдинова Н.В.

288. Комиссионные испытания проведены в соответствии с регламентом, утвержденным проректором КГАВМ по HP, профессором Папуниди К.Х.

289. При исследовании испытуемых материалов в ИФА было установлено, что 20 (25,6%) проб были серопозитивными в отношении хламидийного антигена проверяемой тест-системы, в том числе и все сыворотки реагировавшие в РСК.

290. Результаты комиссионной проверки представлены в приложении к "Акту комиссионной проверки.".

291. Комиссия рекомендует Научно-техническому совету академии рассмотреть и одобрить нормативно-техническую документацию на "Тест-систему иммуно-ферментную для выявления хламидийных антител у собак и кошек"1. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

292. Председатель комиссии, профессор Члены комиссии: профессор доцент1. Р.Г. Госманов1. J. i^/ruiv/iwiinv

293. Результаты исследования сывороток крови собак и кошек, подозрительных по заболеванию хламидиозом

294. Кличка, порода, пол, возраст Клинические признаки Результатыпп исследования в1. РСК ИФА1 2 3 4 51. СОБАКИ

295. Семен, бультерьер, кобель, 10 лет Хронический бронхит, конъюнктивит

296. Ося, боксер, сука, 8 лет Гнойный вульвит

297. Катя, стаффоширский терьер, сука, 8 мес. Цистит, вульвит

298. Цезарь, ср. азиат, кобель, 1,5 месяца Лярингит

299. Тина, ротвейлер, сука, 2,5 м. Бронхит

300. Шурик, шарпей, кобель, 6 лет Артрит, сердечная недостаточность

301. Шархан, ротвейлер, кобель, 6,5 лет Простатит и-к — w

302. Гурда, ризеншнауцер, сука, 7 месяцев Конъюнктивит 00

303. Туя, кок.-спаниель, сука, 8 лет бесплодие

304. Оста, эрдельтерьер, сука, 10 лет Конъюнктивит, отит

305. Дук, пудель, сука, 12 лет мертворожд. плоды, пиометра

306. Тори, черный терьер, сука, 6 месяцев Цистит, вульвит + +

307. Рада, спаниель, сука, 3 года Артрит, бронхит ± +

308. Саша, амер. к.-спаниель, сука, 8 лет Пиометра

309. Рокки, немец, овчарка, кобель, 4 месяца Гнойные выделения из препуция

310. Дик, колли, кабель, 8 лет Хронический бронхит

311. Рой, бульмастив кобель, 3 года Пиодермия, гнойные выделения из препуция

312. Терра, кери-блю терьер, сука, 3 года Выкидыш

313. Дези, пудель, сука, 2,8 лет Бесплодие + +

314. Туй, ризеншнауцер, кабель, 10 лет Баланопостит22. ———, -f f "-"V J • ^J'*"?^^**) "J Зуля, бультерьер, кабель, 4 лет. Бронхит

315. Зера, ротвейлер, сука, 3 года Мертворожден, плоды

316. Дик, немец.овчарка, кабель, 1,5 лет Гнойные выделения из глаз (конъюнктивит)

317. Фрося, фокстерьер, сука, 9 лет Вульвит +

318. Зора, колли, сука, 3 месяца Бронхит

319. Котя, немецкая овчарка, сука, 8 лет Конъюнктивит, экзема +

320. Дик, ротвейлер, кабель, 7 лет Постит

321. Саша, боксер, кабель, 2 года Постит ± +

322. Ося, колли, сука, 8 лет Артрит

323. Ян, русский спаниель, кабель, 7 лет Конъюнктивит, лярингит +

324. Зина, бультерьер, сука, 6 лет Выкидыш +

325. Роза, немецкая овчарка, сука, 5 лет Хронический бронхит + +

326. Изоля, левретка, сука, 3 года Выкидыш

327. Гура, шарпей, сука, 4 месяца Вульвит Н-1 — Ui

328. Глаша, б\п, сука, 4 месяца Бронхит

329. Зухраб, ротвейлер, кабель, 3 года Постит ± +

330. Гера, б/п, сука, 9 месяцев Вульвит, эндометрит +

331. Долли, той пудель, сука, 2 года Выкидыш

332. Дик, бультерьер, кабель, 10 лет Конъюнктивит

333. Сим, колли, кабель, 6 лет Чума

334. Чуй, эрдельтерьер, кабель, 4,5 месяцев Бронхит

335. Тереза, доберман, сука, 3 года Бесплодие1. КОШКИ

336. Мурка, б/п, кошка, 3 месяца Конъюнктивит

337. Пушок, б/п, кот, 1 год Бронхит

338. Кошечка, б/п, кошка, 3 месяца Конъюнктивитt. 5. оадим, и/ii, kui, i,

> )ида Маруся, б/п, кошка, 2,8 лет у pcipni Конъюнктивит, лярингит

339. Шаян, б/п, кот, 4 года Баланопостит ± +

340. Регина, персидская кошка, 1 год Катар- конъюнктивит, выкидыш

341. Семен, б/п, кот, 10 лет Хронический бронхит + +

342. Сонет, сиамская кошка, 1 год Мертворожд. плоды +

343. Соня, персидская кошка, 3 года Конъюнктивит

344. Ося, персидский кот, 3 года Хронический конъюнктивит, бронхит ± +

345. Маша, кошка б/п, 8 месяцев Конъюнктивит, лярингит, бронхит +

346. Катя, б/п кошка, 3 месяца Вульвит

347. Муре, б/п, кот, 6 лет Бронхопневмония + +

348. Мурка, б/п, кошка, 3 года Выкидыш

349. Солнышко, персидская кошка, 4 года Конъюнктивит, выкидыш

350. Пушок, персидский кот, 3 года Бесплоден

351. Черныш, б/п, кот, 5 месяцев Конъюнктивит Ь-1

352. Груша, б/п, кошка, 4 года Бронхит

353. Тима, б/п, кот, 6 лет Цистит, уретрит

354. Алсу, б/п, кошка, 4 месяца Уретрит, цистит

355. Анфиса, б/п, кошка, 3 года Мертворожденые плоды ± +

356. Гуля, б/п, кошка, 2,5 года Конъюнктивит

357. Семен, б/п, кот, 9 лет Астма

358. Махмут, б/п, кот, 2,5 года Бронхит

359. Чишмя, б/п, кот, 2 года Бронхит

360. Сема, б/п, кот, 2 года Конъюнктивит

361. Сима, б/п, кошка, 6 месяцев Бронхопневмония

362. Киса, персидский кот, 1 месяц Истечения из глаз

363. Дуся, сиамская кошка, 1 месяц Конъюнктивит

364. Мурка, персидская кошка, 4 года Бесплодие

365. Персик, персидский кот, 1,2 года — t WilJV Л. JLS x A JL Хронический бронхит +

366. Оскар, персидский кот, 1,3 года Лярингит, бронхит

367. Сонет, персидская кошка, 3 года Бесплодие

368. МИНИСТЕРСТВ О СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОДЛЬСТВИЯ

369. РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт

370. УТВЕРЖДАЮ Резщщ К аз ан с ко й академии ветери-яйрМой медицины, профессор J -J^jaj^u^ К.Х. Папуниди sktPsifezpip 2002 г.

371. ВРЕМЕННАЯ' ИНСТРУКЦИЯ ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ И КОНТРОЛЮ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХЛАМ1ЭДШТНЫХ АНТИТЕЛ У СОБАК И КОШЕК

372. СОГЛАСОВАНО Директор Всероссийского научно-исследовательского ветеринарн ого1. Казань 2002.

373. ПРАВИЛА САНИТАРНОГО РЕЖИМА И МЕР ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ И КОНТРОЛЕ ТЕСТ1. СИСТЕМЫ

374. Производственные штаммы хламидий.3

375. Схема технологического процесса производства тест-системы.3

376. Технология производства тест-системы.35. Контроль тест-системы.136. Упаковка тест-системы.14

377. Хранение и транспортировка тест-системы.15

378. Правила санитарного режима и мер личной профилактики при изготовлении и контроле тест-системы.161. Разработчики:

379. Главный научный сотрудник лабораториивирусологии ВНИВИ. профессор Хамадеев Р.Х.

380. Зав. кафедрой патологии мелких животных и оперативной хирургии КГАВМ, профессор —^y^—-Лл-^

Равилов Р.Х.1. Врач-лаборант РЦПБ СПИД,1. Герасимов В.В.

381. Ассистент каф. патологии мелких животных и оперативной хирургии КГАВМ1мсутдино ва Н.В.

382. Директор Республиканской ветеринарной лаборатории1. Королева Л.В.

383. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОДЛЬСТВИЯ

384. РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт

385. УТВЕРЖДАЮ Вектор Казанской государственной академии ветеринарной медицины, проф^е'сор r^^jf^jc^f К.Х. Папуниди гМа/гъ^г 2002 г.1ШМУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ XJIAM1ЗД1ГЙНБ1Х АНТИТЕЛ У СОБАК И КОШЕК

386. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ТУ 9388 001 — 00493623 — 02

387. Вводятся впервые на опытную партию в количестве 500 наборов Срок введения /г^я/?™?*?2002г.1. Срок действия '2004г.

388. СОГЛАСОВАНО Шч а'ль н и кГл а в н о г о управления ветеринарии Кабинет а министров РТ^рофессрр1. Зшмщб^ А.В. Иванов

389. СОГЛАСОВАНО Директор Всероссийского научно

390. Продолжение на следующей странице

391. Продолжение титульного листа ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ТУ 9388 001 — 00493623 — 021. РАЗРАБОТЧИКИ:

392. Главный научный сотрудник лаборатории вирусологии ВНИВИ, профессор Хамадеев Р.Х.ф-р^Я * >f 2002 г.

393. Зав. кафедрой патологии мелких животных и оперативной хирургии КГАВМ, профессор —с Равилов Р.Х " Л8 " ^b^^^^Jj 2002 г.1. Врач-лаборант РЦГ1Б СПИД,к.б. н Герасимов В.В.2002 г.

394. Ассистент каф. патологии мелких животных и оперативной хирургии КГАВМ

395. Шамсутдинова Н.В. ".<//'.jjh^A^c^^- .2002 г.

396. Директор Республиканской ветеринарной лаборатории

397. Королева Л.В. fL&fyC*^2002 г.

398. ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ КАБИНЕТА МИНИСТРОВ РЕСПУБЛИКИ ТАТРСТАН Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт

399. СОГЛАСОВАНО Ректор Казанской академии ветеринарной медицины, профессор1. К.Х. Папуни,iSiX^ 2002 г.- утверждаю

400. Иммуноферментная тест-система для выявления хламидийных антител у собак и кошек представляет собой набор реагентов для проведения ИФА.

401. Порядок предъявления рекламаций.

402. Главный научный сотрудник лаборатории вирусологии В НИВ И, профессор Хамадеев Р.Х.

403. Зав. кафедрой патологии мелких животных и оперативной хирургии КГАВМ, профессор ^Лл^л ¦ Равилов Р.Х.

404. Врач-лаборант РЦПБ СПИД, к.б.н.—izfri7 Герасимов В.В.

405. Ассистент каф. патологии мелких животных и оперативной хищ?>гии КГАВМ1. Шамсутдинова Н.В.

406. Директор Республиканской ветеринарной лаборатории1. Королева Л.В.1. СОГЛАСОВАНО"1. ИВИ, академик АНТ,1. А.З. Равилов 2000 г.1. УТВЕРЖДАЮ"

407. Начальник Главного Управления и KM1. А.В. Иванов 2000 г.1. ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕпо применению вакцины против хламидиоза плотоядных животных (пушных зверей, собак и кошек) инактивированной эмульсионнойв порядке опыта)1. Общие положения

408. Вакцина предназначена для профилактики хламидиоза у пушных зверей, собак и кошек.

409. Вакцина выпускается: в запаянных стеклянных ампулах по 0,5 и 1 мл; в плотно закрытых резиновыми пробками (обкатанными металлическими колпачками) стеклянных флаконах по 2, 5, 50 и 100 мл. Ампулы и флаконы этикетируются в соответствии с ТУ.

410. Перед применением ампулы и флаконы с вакциной подогревают до 20-25°С и тщательно встряхивают.

411. Порядок применения вакцины

412. Клинически здоровых животных вакцинируют однократно. Ревакцинация через 6 месяцев. Самок иммунизируют за 21-28 дней до случки.

413. Больных хламидиозом плотоядных животных перед вакцинацией подвергают обработке антибиотиками, эффективными в отношении хламидий,и симптоматическому лечению. Иммунизацией переболевших животных можно проводить через 10-15 дней после курса терапии.

414. Вакцину применяют глубоко внутримышечно в области бедра. Животным с живой массой менее 10 кг в дозе 0,5 мл, свыше 10 кг 1 мл (независимо от возраста).

415. У иммунизированных животных на месте введения вакцины может появляться болезненность и небольшая припухлость, которые исчезают в течение 2-3 недель.

416. Иммунитет у привитых животных наступает через месяц после вакцинации и сохраняется 6 месяцев.

417. Шкурки, полученные после убоя вакцинированных пушных зверей, реализуют без ограничений.

418. Ведущий научный сотрудник ВНИВИ, профессор1. Научный сотрудник ВНИВИ,1. Хамадеев Р.Х.кандидат вет. наук'X'71. Хусаинов Ф.М.

419. Заведующий кафедрой патологии мелких животных КГАВМ,доктор вет. наукдоктор вет. наук — Равилов Р.Х.

420. Ассистент кафедры патологии мел вотных КГАВМ,1. Шамсутдинова Н.В.

Источник: http://medical-diss.com/veterinariya/diagnostika-i-profilaktika-hlamidioza-domashnih-plotoyadnyh-zhivotnyh

Популярное:

  • Красный перец от герпеса Перец. Полезные и целебные (лечебные) свойства перца. Чем полезен перец. Лечение перцем Перец обладает лечебными и целебными свойствами. Перец широко используется в народной и традиционной медицине, благодаря своему целительному составу. В состав перца входят многие необходимые организму витамины, минералы и полезные […]
  • Календула настойка при мастопатии Лечим мастопатию настойками: из пиона, календулы, перегородок грецких орехов и другие Число женщин, страдающих мастопатией увеличивается с каждым годом. Использование настоек от мастопатии имеет ряд преимуществ. Именно поэтому их широко применяют женщины, страдающие данным заболеванием. Дать шанс женщине избежать в […]
  • Циклоферон при молочнице схема лечения Циклоферон в лечении артритов – Циклоферон совместим с другими препаратами, используемыми для лечения артритов, практически не вызывает побочных эффектов и отличается хорошей переносимостью. Циклоферон назначают больным с ревматоидным артритом в составе комплексной терапии, на фоне базисного лечения нестероидными […]
  • Клиника лечения молочницы Многие женщины считают молочницу абсолютно безобидной, а реклама современных лекарственных препаратов как бы даже освобождает нас от необходимости идти к гинекологу. Милые дамы на телеэкране сами ставят себе диагноз и назначают курс лечения. «Три дня, и молочницы как ни бывало!» - сплетничают они за чашкой чая. Молочница […]
  • Диферелин 375 отзывы при эндометриозе Диферелин представляет собой лекарственный препарат с антигонадотропным действием, то есть, по своей сути, он является антигормоном, поскольку подавляет выработку фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов (ФСГ и ЛГ) у женщин и тестостерона у мужчин. Поэтому Диферелин используется для лечения эндометриоза, миомы […]
  • Лазерное удаление папиллом в ростове Обзор лучших и самых посещаемых клиник в Ростове-на-Дону по лечению бородавок Сейчас в городе активно развивается жилищное строительство. С каждым годом все больше людей стремятся приехать на постоянное место жительство именно в Ростов-на-Дону. Содержание: В данном салоне бородавки удаляют двумя наиболее эффективными […]
  • Истории болезни гиперплазия эндометрия Атипическая гиперплазия эндометрия. История болезни Резус фактор: положительный Дата и время поступления: 13.05.2008 года в 9:30 Дата начала курации: 22.05.2008 года 10. Дата окончания курации: 24.05.2008 года Паритет: В анамнезе – 6 беременностей, 4 аборта ( в 1976, 1978, 1980, 1983 годах), 2 родов. Адекватной реабилитации […]
  • Горец от цистита Лечение цистита народными средствами у женщин: рецепты, отзывы May 2, 2015 Цистит – это инфекционное заболевание. В нашем организме живут возбудители данной болезни, попадая в мочевой пузырь из прямой кишки. Чаще всего с этой болезнью сталкиваются женщины (по статистике, каждая пятая женщина планеты страдает от этого […]
  • Как лечить сифилис форум Симптомы После заражения инкубационный период продолжается от 3 до 6 недель. Дальше наступает острая стадия, которая длится примерно месяц. Характерные симптомы при этом таковы: появление изъязвлений в месте проникновения инфекции диаметром не больше 2 см; локальное увеличение лимфоузлов; отечность окружающих […]
  • Беременность после генитального герпеса Генитальный герпес у женщин Что такое половой герпес? Генитальный, или половой герпес – это заболевание половых органов, вызываемое вирусами простого герпеса (ВПГ или Herpes simplex virus, HSV). Сейчас известно 8 типов вируса герпеса, из которых генитальный герпес вызывают первые 2 типа (ВПГ-1 и ВПГ-2). В 80% случаев […]
Закладка Постоянная ссылка.

Комментарии запрещены.